使用磁激活细胞分选纯化 CD31 + 内皮前体细胞

0 次观看5:32 分钟 • July 8th, 2025

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取内皮祖细胞或 EPC 的贴壁培养物,EPC 是脑微血管内皮细胞的前体。

通过分化多能干细胞获得的培养物包括表面标志物CD31阳性和污染CD31阴性细胞的EPC。

与解离试剂孵育以分离细胞并过滤以获得单细胞悬液。

加入培养基以中和酶,离心以弃去上清液,并将细胞重悬于缓冲液中。

与封闭试剂一起孵育以抑制细胞Fc受体,防止非特异性标记。

加入对 CD31 具有特异性的荧光团偶联抗体并孵育以标记 EPC。

心并丢弃未结合的抗体。与含有一种与荧光团结合的抗体的抗体复合物一起孵育。

引入聚合物包被的磁性纳米颗粒并孵育,使纳米颗粒与复合物的第二抗体结合。

使用磁场,分离纳米颗粒结合的细胞。

去带有未标记的CD31阴性细胞的悬浮液,并将纯化的细胞重悬于培养基中。CD31阳性EPC已准备好进行下游检测。

在内皮祖细胞培养的第 5 天,从孔中吸出培养基,并向每个孔中加入 1 毫升解离试剂。将板在 37 摄氏度下孵育 6 至 8 分钟。使用微量移液器,解离并使细胞奇异化,然后将细胞悬液通过 40 微米细胞过滤器,过滤到含有 10 毫升 DMEM/F-12 培养基的 50 毫升管中。

要停止消化反应,请加入DMEM / F-12 / 10 10培养基至50毫升标记。彻底移液并保留 10 微升用于计数细胞。将 50 毫升管在 200 至 25 摄氏度下以 200 g 离心 5 分钟以沉淀细胞。离心后,除去上清液,用10毫升DMEM / F-12 / 10培养基重悬细胞沉淀。

细胞悬液转移到新鲜的 15 毫升管中。在20至25摄氏度下以200g离心5分钟,以再次沉淀细胞。然后,将细胞沉淀重悬于流动缓冲液 1 中。接下来,以 1 比 100 的比例加入 FcR 封闭试剂并孵育 5 分钟。然后,加入1比200比例稀释的异硫氰酸荧光素或FITC标记的CD31抗体。

悬浮液在20至25摄氏度的温度下在黑暗中孵育30分钟。在孵育结束时,向样品中加入10毫升流动缓冲液1,并保留10微升悬浮液用于流式细胞术分析,以确定CD31阳性细胞的分数。将细胞在20至25摄氏度下以200g离心5分钟。离心后,用流动缓冲液 1 溶液重悬细胞。

接下来,每 100 微升细胞悬液加入 5 微升 FITC 选择混合物。通过移液彻底混合溶液,并在 20 至 25 摄氏度的温度下在黑暗中孵育 15 分钟。接下来,每 100 微升细胞悬液添加 5 微升磁性纳米颗粒。充分移液混合物,并在20至25摄氏度的黑暗中孵育10分钟。

细胞悬液转移到 5 毫升流式细胞术管中,并加入流动缓冲液 1 以获得 2.5 毫升的总体积。然后,将流式细胞术管放入磁铁中五分钟。在连续运动中,倒置磁铁并倒出含有FITC-CD31抗体未标记细胞的细胞悬液。将磁铁和管子保持在倒置位置 2 至 3 秒,然后取出剩余的液体。

在将

试管返回直立位置之前,吸出试管边缘的所有液滴。从磁铁中取出流式细胞术管,并加入 2.5 毫升流动缓冲液 1 以洗涤剩余的 CD31 阳性细胞。轻轻地上下移液细胞,两到三次以重悬它们。然后,将流量管放入磁铁中五分钟。

重复洗涤至少四次,以从管中取出FITC-CD31未标记的细胞。从磁铁上取管,并用所需量的合适培养基重悬纯化的CD31阳性细胞。保留两个1微升等分试样的悬浮液,一个用于细胞计数,另一个用于进行流式细胞术分析,以评估磁后活化细胞分选样品中CD31阳性细胞的纯度。

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最后更新:1 八月 2026