将人类神经干细胞分化为神经前体细胞和星形胶质前体细胞

从非黏附性神经球开始，这是一种在细胞培养衍生的条件培养基中生长的人类神经干细胞三维聚集体。

这种培养基含有维持细胞活力的营养物质、生长因子和细胞外基质成分。

离心收集神经球。

用胰蛋白酶和DNase酶处理，混匀内容物，然后进行孵育。

胰蛋白酶可破坏细胞间的黏附作用，促进细胞脱落，而脱氧核糖核酸酶（DNase）则降解游离DNA，防止细胞聚集。

反复吹打内容物以形成单细胞悬液。然后加入胰蛋白酶抑制剂以中和酶活性。

离心并移除上清液，然后将细胞重悬于含有神经生长因子的增殖培养基中。

将细胞悬液接种到置于多孔板中的聚合物包被的盖玻片上。孵育以使干细胞贴附于聚合物表面。

此外，根据对特定生长因子的吸收，干细胞会分化为神经细胞和星形胶质细胞前体细胞，这些前体细胞已准备好进一步成熟为特定类型的细胞。

根据文本方案配制培养基并接种人神经干细胞后，从培养箱中取出待传代的细胞培养瓶，移入生物安全柜（BSC）中。轻轻倾斜培养瓶，使细胞沉降到聚集的培养基底部。

将10毫升培养基转移至一个洁净的15毫升离心管中，该管标记为“CM”（条件培养基），并将其均分为两份5毫升的等分试样。注意不要吸入任何沉降在培养瓶底部的细胞。从CM管中取出3毫升培养基，转移至另一个标记为“胰蛋白酶抑制剂溶液”的15毫升离心管中。然后将CM管暂时放置一旁。

接下来，移除T75培养瓶中剩余的5毫升培养基和细胞，并将其放入已标记为“细胞”的洁净15毫升离心管中。然后，使用刻度移液管，每次加入3.5毫升CM培养基，对T75培养瓶冲洗两次，并将冲洗液转移至“细胞”管中。此步骤可将所有神经球从T75培养瓶中彻底清除。

将“cells”离心管在室温下以100 × g 离心5分钟。在细胞离心的同时，从37摄氏度水浴中取出预先配制的DPBS葡萄糖溶液，并加入适量的胰蛋白酶和DNase。

当“cells”离心管停止旋转后，移除所有条件培养基上清液，并将其转移至CM管中。向15毫升离心管中的细胞沉淀加入胰蛋白酶溶液，使用5毫升移液器上下吹打约5至10次。盖紧管盖，于37摄氏度水浴中孵育5分钟。

向胰蛋白酶抑制剂管中加入适量体积的胰蛋白酶抑制剂，所加溶液体积应与胰蛋白酶溶液使用的体积相同。然后将胰蛋白酶抑制剂溶液置于37°C水浴中，待用时取出。

孵育结束后，将细胞轻轻吹打5到10次。然后将样品置于37摄氏度水浴中继续孵育10至15分钟。细胞孵育结束后，上下吹打细胞直至球状结构完全解离。随后立即加入胰蛋白酶抑制剂溶液，并将细胞悬液上下吹打10次。

为计数悬浮液中的细胞数量，用移液器吸取15微升台盼蓝预混液至小型称量皿中，加入5微升细胞悬浮液。上下吹打3至5次以充分混匀。随后，将10微升台盼蓝细胞悬液转移至血细胞计数板两侧，血细胞计数板表面需覆盖盖玻片。

在光学显微镜下观察细胞，计数四个角上每个方格内的细胞总数，然后将这些数值相加。根据文本方案计算细胞数量后，向每个T75培养瓶中加入适量体积的细胞悬液，使每瓶含有5 × 10⁶个细胞。

如果体积少于 5 毫升，需添加条件培养基至总体积达到 5 毫升。然后向培养瓶中加入 10 毫升含有生长因子的新鲜 DFHGFPS 培养基。确保培养瓶上标注细胞类型、日期、培养瓶中的细胞数量以及传代次数。如有需要，此时可将细胞放入培养箱中孵育。

接种贴壁型HNSCs时，传代前一天，按照文本方案中所述方法清洁生物安全柜，并使用镊子将单个无菌的12毫米玻璃盖玻片放入24孔板的各孔中。每孔加入250微升含0.01%多聚-D-赖氨酸（Poly-D-Lysine）或PDL的无菌水溶液，对带盖玻片的孔进行包被，并在37摄氏度下孵育1小时。移除PDL溶液后，再用每平方厘米1微克的层粘连蛋白DPBS溶液对孔进行包被。

将培养板在37摄氏度下孵育过夜。如果次日无需使用，则用封口膜包裹培养板边缘以密封，并在4摄氏度下保存。通过抽吸去除各孔中多余的层粘连蛋白溶液，用0.5毫升DPBS将各孔冲洗一次。然后以每平方厘米0.6至1×10⁵个细胞的密度将细胞接种至各孔中。