利用人诱导性多能干细胞生成前脑型脑类器官

从含有在添加了Rho激酶抑制剂的干细胞培养基中培养的人诱导性多能干细胞（iPSCs）的低吸附培养板开始。

抑制剂进入细胞，阻断Rho激酶酶活性，维持细胞活力，从而促进iPSC集落的形成。

更换为干细胞培养基，使细胞聚集体生长。将其转移至含有皮质诱导培养基的低吸附培养皿中。

该培养基的成分可诱导iPSCs分化为神经外胚层细胞，即一种神经前体细胞。

将每个神经外胚层聚集体转移至带有浅孔的薄膜上。

用基底膜基质替换培养基，并孵育以使基质凝固并包埋细胞聚集体。

将这些包埋在基质中的聚集体转移至含有皮质诱导培养基的培养皿中，并在振荡条件下孵育。

随着时间的推移，神经外胚层细胞利用分化因子并发育为神经上皮细胞。

将培养基更换为类器官分化培养基，以促进细胞成熟为更特化的细胞类型，形成类似于前脑皮层的脑类器官。

为了生成多能干细胞聚集体，当干细胞培养物达到70%至90%融合度时，向六孔培养板的一个孔中加入500微升细胞解离试剂，以解离细胞。

诱导性多能干细胞在适应单层培养条件后，是形成细胞聚集体的理想细胞类型，因为在解离和聚集体形成过程中，这类细胞较不易因应激而发生细胞死亡。

在37摄氏度下孵育5至10分钟后，轻轻敲击培养板，用2毫升DMEM/F-12培养基将细胞从孔底冲洗下来。将所得的细胞悬液转移至15毫升锥形管中，并用更多DMEM/F-12培养基将细胞溶液体积补至10毫升。

计数后，将每4.5 × 10³个 多能干细胞聚集体转移至新的15毫升离心管中，通过离心收集细胞。用适量的多能干细胞培养基重悬细胞沉淀，并添加50 μM ROCK抑制剂，以获得4.5 × 10³ 每150微升培养基中的细胞数

接下来，将150微升细胞加入96孔低吸附U型底板的各个孔中，并将该板置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中。为监测前部神经外胚层诱导情况，每天使用组织培养显微镜在低倍镜下密切观察多能干细胞聚集体的形态变化。

第1天应观察到边界清晰的细胞聚集体。第2天，小心吸出约2/3的培养基，注意不要扰动每个孔底部的细胞聚集体，并将弃去的培养基替换为100 µL新鲜的多能干细胞培养基。

四到六天后，当细胞聚集体直径达到 350 至 450 微米且边缘光滑时，使用经改造的 100 微升移液枪头，将最多 20 个聚集体转移至一个含有 5 毫升皮质诱导培养基的 6 厘米低吸附培养皿中。

每三天更换一次皮质诱导培养基，并每天在4倍物镜下观察细胞聚集体的形态变化。在皮质诱导培养基中培养四到五天后，细胞聚集体边缘表面应开始变亮，表明神经外胚层分化启动，同时出现假复层上皮的放射状结构组织。

为了将神经外胚层聚集体嵌入基质支架中，需在冰上填充基底膜提取物，持续两到三小时。在提取物解冻的同时，使用无菌剪刀将塑料石蜡膜剪成每16个类器官对应一个4厘米×4厘米的正方形，并将每片膜放置在空的100微升微量移液器吸头盒上。

用戴着手套的指尖按压石蜡膜，使其表面出现微小凹陷，并用70%乙醇清洁石蜡膜。在密闭的无菌生物安全柜中经紫外线照射30分钟后，使用经改造的、开口直径为1.5至2毫米的100微升移液器吸头，将每个细胞聚集体转移至石蜡膜的一个凹陷中。

当所有类器官转移完毕后，使用未剪切的100微升移液枪头小心吸去每个凹孔中的培养基，并向每个细胞类器官中加入40微升未稀释的基底膜提取物。

操作时需小心，避免因剧烈操作或吸入移液器吸头而损伤类器官，否则会破坏正在发育的神经上皮。

使用移液枪头将聚集体移至每滴液滴中央，用无菌镊子小心地将塑料石蜡膜片转移到10厘米的培养皿中。将培养皿放入培养箱中孵育15至20分钟。

当提取物凝固时，向一个六厘米低吸附培养皿中加入5毫升新鲜皮质诱导培养基。孵育结束后，将石蜡膜片翻转，用无菌镊子轻轻将最多16个已聚合的液滴转移至每个六厘米培养皿中。然后，将细胞聚集体放回细胞培养孵箱中。

次日，将类器官培养皿转移至细胞培养摇床中，置于细胞培养箱内，以5度倾角、14 RPM转速进行摇动培养，并每天通过光学显微镜监测，直至聚集体达到目标分化阶段。