微阵列后探测器（mPADs）:机械力的方法来隔离

大家好，我是 Nathan Snia Deky，今天和我在一起的是 Wes Ligan、Robbie Desai 和 Mike Yang。我们来自宾夕法尼亚大学 Chris Chen 的实验室。在本视频中，我们将介绍使用微预制柱阵列测量细胞吸引力的方法。

牵引力是通过肌球蛋白和作用子相互作用产生的，在我们的生理学中起着重要作用。在发育过程中，它们使细胞能够从一个位置移动到另一个位置，以形成我们组织的早期结构。它们还有助于愈合过程，因为它们对于闭合伤口或白细胞在我们体内的迁移和爬行是必需的。

但不幸的是，在癌症转移或血管向肿瘤生长的情况下，这些相同的力量可能对我们的健康有害。因此，很少有方法可以真正以定量方式测量这些牵引力，尤其是在单个细胞的微米级和纳米级。体外研究细胞的大多数常用方法是使用玻璃底培养皿或聚苯乙烯培养皿，但这些是非常坚硬的基材，它们不是，它们不允许我们实际测量细胞的牵引力和造成的诽谤。

因此，如果没有某种物理读数，就很难理解牵引力的潜在机制。因此，在 Chris Chen 的实验室中，我们有一种技术可以让我们克服这些限制。我们的方法基于垂直阵列的柔性悬臂，其刚度和尺寸尺度使得单个单元将分布在多个悬臂上并在此过程中使它们偏转。

我们最常用的尺寸是直径为 3 微米的圆柱形柱子直径，高度为 10 微米，中心间距为 9 微米，呈矩形阵列。但是，这些尺寸可以改变以适应各种细胞研究。我们从您可以在此处看到的刚性硅母子开始，然后将其转化为我们在此处看到的柔性 PDMS 悬臂。

使用这种技术，我们可以在显微镜下测量单个悬臂的挠度，并以产生这种挠度所需的大小和方向回传蜂窝牵引力。我们已经将这些衬底变成了用于微后阵列探测器的 M 焊盘，在本视频中，我们将向您展示如何制造 M 焊盘，从硅胶母板开始，到 PDMS 复制，最后到调制和细胞收缩力的计算。您好，我们来到了实验室的洁净室。

这是一个无尘且对光线敏感的房间，允许我们制作 SU 八个柱子，这些柱子将用作硅主控。我们首先从硅片开始，然后涂上 SU 8 光刻胶，SU 8 是负性光刻胶，它是光敏的。因此，当我们通过这个照片掩模照射光线时，它会导致光线形成微柱，然后形成三维结构，这就是我们在 PDMS 中铸造的 SU 八个柱子。

因此，在我们完成所有加工后，晶圆将看起来像这样，这就是我们的微柱，即已经制造到晶圆中的微柱结构的地方。因此，为了制作母版，我们首先从一个裸硅片开始，用臭氧处理清洁了 7 分钟，我们还在 120 摄氏度下将这个硅片脱水了 30 分钟。我们将 SU 8 2002 旋转到此上，以形成一个非常薄的柱子基础层。

所以因为我们要旋转 SU 8，所以我要戴上防毒面具，将晶圆重新装入这个支架，除去那里可能出现的任何灰尘，把它放在旋转器上，我们要检查以确保它居中，然后我们将继续将 SU 8 2002 倒在上面。然后我们继续旋转晶片。然后，我们将这些放在热板上，即软烤。

之后我们这样做一分钟。然后我们把它转移到 95 度的热板上。我们这样做两分钟。

完成后，我们现在就拿着这个，开始在掩模对准器中进行洪水暴露。好了，我们刚刚旋转了 SU 8，即该晶圆上 SU 8 的第一层，现在我们需要对整个晶圆进行泛洪曝光，为微柱创建第一个基层。所以我们需要给这个 70 毫焦耳的曝光。

因此，我们需要在此处测量掩模对准器中光线的实际强度。所以我们将仪表装入砝码中，放入掩模对准器中。然后我们用光曝光它。

这里是紫外线。我们将硅片加载到掩模对准器上，将其放入掩模对准器中。而且我们这次没有遮罩，这样我们就可以曝光整部电影。

让我们打开快门，然后继续调高一分钟的曝光时间，然后继续进行曝光。因此，在系统完成一分钟后，我们可以取出晶圆。现在我们需要进行曝光后烘焙。

所以我们刚刚曝光了这个晶圆，现在我们要添加热量，使 SU 8 的第一层涂层发生交联反应。因此，我们将其放在 65 度的热板上 1 分钟，然后转移到 95 度的热板上 2 分钟。经过两分钟的处理后，我们关闭加热板，让晶圆冷却回室温，这大约需要 30 分钟。

因此，我们将第二层 SU 8 旋转到这个晶圆上。现在我们需要通过照片蒙版实际曝光这一点。这次，我们将使用 UV 滤镜来阻挡深紫外线。

这是您可以获得的 Hoya 光学玻璃，但这次我们需要再次测量强度。因此，我们将使用测光表，或者使用顶部的滤光片来测量被过滤掉的强度。然后我们将掩模加载到掩模对准器中。

此开关产生真空，将面罩固定到位。然后，我们会将其放入掩模对准器中。然后，我们将过滤器放在顶部，然后装入我们的晶圆。

我们想确保有良好的接触，所以我们把它提高到接触状态，然后我们将开始曝光。曝光后，我们将晶片从掩模对准器中取出。所以现在我们有选择性暴露的区域。我们会把它带到烤箱里，带到热板里，在上面做曝光后烘烤。

我们刚刚完成了 The po，最后的曝光后烘烤，现在我们要开发这个晶圆，这样我们就可以真正获得 3D 结构。我们要做的是清洗它，在 P-G-M-E-A 中显影，这将洗掉未暴露的 SU 8。因此，我们首先从一盘 P-G-M-E-A 开始，然后将威化饼在这里静置两分钟，并轻轻搅拌。

所以我要放下它两分钟。所以我们要转移到 P-G-M-E-A 的第二道菜。这将去除带有 SU 8 的饱和 P-G-M-E-A。

10 秒后，我们会将其导入 IPA。这会冲走 P-G-M-E-A。我们把它放在这里 20 秒，再次带着一些轻微的搅动。

然后现在我们有独立的柱子结构。因此，我们将其放入表面张力较低的己烷中。我们要在 1 个己烷中洗涤 5 秒钟，然后是 2 个己烷，然后我们准备吹干它。

我们刚刚开发了晶片，现在我们要把它放在热板上，慢慢地将温度升高到 1 50。发生的情况是，这种更高的温度进一步使 SU 8 交联，使其在结构上更加坚固，我们将其放在这个热板上过夜。因此，在 14 到 20 小时之后，我们将关闭热板并让它再次冷却至室温。

所以我们需要做的是将这个晶圆切成更小的尺寸。我们基本上想切割这个硅片，然后在这里创建一个具有这种内部图案的小芯片。那里看起来会像这个结构一样，他们将使用环氧树脂。

我们将像这样将芯片粘在载玻片上。这提供了一个结构性的支持。所以对晶圆进行切割，这是一种艺术，但你可以做的是基本上使用金刚石划线器，你只从一个边缘开始。

由于晶面的原因，你只需放一个小缺口，现在已经产生了一个裂缝，然后我可以用这个工具点击它，我们可以把它剥开，然后我们可以在这里做更多的切割，直到我们得到一个这样的小结构。然后，您现在快速将硅芯片放在玻璃上并将其安装到位。然后你让它设置。

所以在你完成后，你会有一个，你会有一个与此类似的设备。因此，我们已经将硅母版安装到这个载玻片上，现在我们要给它涂上一层 floy 涂层，这将有助于稍后从 PDMS 中释放这个结构。因此，我们将芯片放入干燥液中，然后从 tri Chloro Siling 中取出几滴滴入干燥液中。

我们在引擎盖内这样做，因为这是氢盐酸气体的副产品，非常苛刻。继续合上盖子，将其连接到真空中，然后我们继续让它从真空中放置，我们让它沉积过夜，以在整个硅片上获得良好的涂层。大家好，我是 Wesley Ligan。

我是 Christopher Chen 实验室的研究生。在这一点上，Nate 已经向您展示了如何为我们的 ED 基材创建硅胶母版。然而，在我们可以使用这个工具来测量细胞收缩力之前，必须先使用弹性硅聚合物复制刚性光结构。

我们的首要任务是生成我们之前制造的硅胶母版的负片模板。我们使用一种称为 PDMS 或聚甲基 Sloane 的硅弹性体来制造 PDMS 聚合物。我们现在添加 1 比 10 的固化剂。

称量溶液后，有必要将 PDMS 聚合物和交叉泄漏剂充分混合。这种混合显然会在我们的解决方案中引入大量气泡。所以此时，有必要将其去盖并在真空干燥中脱气。

一旦 PDMS 完全脱气并且所有气泡都上升到表面并爆裂，我们就可以将其从真空干燥中取出。我们现在可以使用 PDMS 和交联剂的混合物来生成硅母模的负模。为此，我们使用一个 pie tin 并将安装好的 Silicon Master 放在它的中心。

然后，我们小心地将 DGA 聚合物溶液倒入硅晶片顶部的培养皿中，试图防止形成任何额外的气泡。通常，我们尝试倒入大约四分之一英寸厚的聚合物。您可以看到，这个过程不可避免地会在混合物中引入一些气泡。

所以现在我们将这个盘子放在一边大约 30 分钟，让气泡上升到表面并爆裂。我们可以看到，静置后，PDMS 表面仍然有一些气泡。然而，由于这些气泡位于顶部表面，我们现在可以使用快速的氮气来爆破任何剩余的气泡。

为了使 PDMS 和 CROSSLINKER 溶液完全交联并生成硅母版的刚性负模板，我们在 110 摄氏度下烘烤 20 分钟。我们可以看到，在硅胶衬底的顶部有一层薄薄的 PDMS。在我们把两者分开之前，有必要先切掉这一层。

然后我们可以嫁接这个顶层，轻轻地将其从硅衬底上剥离。此时，我们可以反转并非常缓慢地剥离负极硅衬底，即负极 PDMS 衬底远离硅胶母版。好的，我们通过按住一端并轻轻剥离 PDMS 基板来做到这一点。

当基材从硅胶母版上剥离时，您可以看到正面向前推进。现在我们已经生成了硅胶母模的 A-P-D-M-S 阴模，我们可以将其切割成四个单独的阴模来制作最终的垫基板。此时重要的是，不要用镊子或手套接触负基底的顶部，以免损坏表面。

因此，在这一点上，我们从硅胶母版中生成了四个单独的负模板，由三个直径为 9 微米的孔组成。为了再生凸起的悬臂表面，我们可以利用 PDMS 从 PDI PDMS 在这些负模上再次铸造。然而，在我们这样做之前，有必要首先通过涂上氟离子来使这些负模不粘

我们在 100 瓦等离子室中以全功率进行一分钟。在允许腔室抽空等离子体的回流后，这会产生一个离子气体场，该离子场会蚀刻 PDMS 顶面，使其与荧光 Cy Lane 分子更具粘附性。从真空干燥中取出负模后，您可以在这里看到我们只剩下一组 3 微米 x 10 微米深的井，位于非粘附性 PDMS 层中。

为了再生我们用于 mpad 基板的垂直悬臂，有必要使用相同的 PDMS 混合物再次将其铸造掉，这将为我们留下一个积极的独立式悬臂阵列，它们与我们之前制造的硅母子完全相同。该程序的第一步是将我们的非粘性阴模转移到我们用 PDMS 条和玻璃显微镜载玻片制成的安装夹具上。此钻机的原因将在下一步中变得清晰。

此时，我们可以将一小滴相同的 10 比 1 PDMS 混合物浇注到已经脱气的交联剂中，并将其浇注到每个阴模的顶面上。只需要少量的 PDMS，这样它就不会流到阴模的边缘。在这一点上。

为了将 PDMS 更充分地分布在模具的顶面上，我们可以用镊子抓住一个，将其倒置，然后使其与相邻的模具接触，小心地分布在 PDMS 周围，以完全覆盖整个基材。在此步骤中要非常小心，不要将进一步的气泡引入顶部 PDMS 溶液中，然后可以用其他两个孔、其他两个模具重复。现在，我们的顶面已经有了更均匀的 PDMS 涂层，我们可以将此夹具放入真空干燥器中，以进一步去除可能滞留在阴模顶部 PDMS 薄膜中的任何气泡。

此过程通常需要大约 30 分钟。当我们的阴模脱气时，我们可以清洁 22 x 22 毫米的玻璃基板，这将成为焊盘的最终安装位置。此过程的第一步是使用压缩氮气吹掉任何灰尘颗粒。

我们将玻璃盖玻片暴露在气体等离子体中，这将使表面灰化，使其对 PMS 更具粘附性，我们将在下一步中坚持使用。在将 PDMS 顶层放入 DGA 中约 30 分钟并等离子体激活玻璃盖玻片后，我们可以移除模板，并将暴露于气体等离子体的玻璃盖玻片的顶面与负模顶部的 PDMS 层接触。通常，它有助于先使玻璃盖玻片的一个边缘与 PDMS 接触，然后让玻璃盖玻片的其余部分沉降在 SH 中，以便 PDMS 以片状方式展开。

这有助于减少引入 PDMS 薄膜的任何气泡。此时，我们可以用镊子轻轻按压玻璃盖玻片的顶面，以推出任何多余的 PDMS，并将盖玻片向上推向模板中心的 PDMS 十字架。这将防止 PDMS 固化时盖玻片移动。

我们对其他基材重复此作。此时，我们可以将整个模板转移到烤箱中，并在 110 摄氏度下烘烤 22 小时。让整个组件冷却到室温后，我们可以移除基板，将它们倒置，然后小心地从玻璃盖玻片上剥离负模。

缓慢而均匀地执行此作，以避免压碎柱子或从玻璃基板上撕下它们。我们可以看到，在剥开负模后，我们只剩下一系列精确模仿 Silicon Master 的悬臂，只是现在它们所在的位置是由柔性 PDMS 弹性体构成的。好的，现在我们已经向您介绍了我们如何生成 Emad 衬底的 Silicon Master。

然后，我们使用复制成型工艺，使用 A-P-D-M-S 弹性聚合物生成精确的复制品，这样，悬臂现在就很灵活，可以让细胞在这个过程中展开和收缩并偏转悬臂。此时，我们的底物已准备好进行细胞培养处理。现在我们已经了解了如何制造和复制模具来制造 EDS，我们将再做一些步骤来使 EDS 发挥作用，以便我们可以培养自己并随后分析牵引力。

但在我们这样做之前，我们需要做三件事。我们需要将柱子的尖端粘合到单元格上。其次，我们需要荧光标记 PDMS，以帮助可视化和分析后偏转。

第三，我们需要使柱子的侧壁以及柱子的底部不粘附到细胞上，以便仅将牵引力施加在柱尖上。因此，在接下来的几分钟中，我们将看到这些步骤如何通过基于微触点打印的策略进行。但首先，下一步是清除 eds 中多余的 P-D-S-P-D-M-S。

所以就像我提到的，第一步是取 EDS 基板，West 刚刚向您展示了如何生成和修剪它们。固化玻璃盖板时，由于玻璃盖板会滑落到阴模上，并使用锋利的剃须刀片修剪，从而导致多余的 PDMS。对于多余的 PDMS，您可以通过将剃须刀片垂直向下放在柱子边缘的基材上，然后刮掉来实现。

您可以用一根手指将盖玻片固定到位，这样盖玻片就不会移动。因此，我们最终得到的是一个 M 垫基板，它已经清除了碎屑，因此很容易接近。因此，下一步，我们必须微接触，打印 MPA 以使柱子的尖端具有粘合性。

为此，我们首先需要生成邮票，这个过程非常简单。我们只需将 PDMS 混合在一起，而不是 10 比 1 的比例，而是 1 比 30 的比例。我们倒入培养皿中，使 PDMS 高度约为 1 厘米。

让它脱气。也就是说，让气泡上升到 PDMS 的顶部，并在 60 度的烤箱中固化交联反应一小时，然后将培养皿从烤箱中取出并冷却后，我现在准备剪下印章。因此，同样，使用相同类型的剃须刀片，只需垂直向下按压至 PDMS 中进行切割，直到接触到培养皿的底部。

现在邮票的方向是我们要注意的事情。印章表面将是 PDMS 的一侧，该侧面被铸造在培养皿的底部，以便保持平坦。因此，在我剪下的这个大正方形 PDMS 中，邮票表面现在是正面朝上的。

现在这个邮票比 M 垫大得多，所以我要用剃须刀片再次切割它，把它修剪成一个 M 垫的大小，因为很难用肉眼判断邮票的正确方向，我要在邮票的背面放一个小缺口，也就是非面，就像这样。然后我可以从较大的板上去除邮票。我现在有了下一步的 A-P-D-M-S 印章。

我们想要清理 PDMS 标记。因为在我切割 PDMS 邮票时，大气中的灰尘很可能已经沉积在 PDMS 邮票上。在这个过程中，我们将所需数量的 PDMS 印章放入该结晶皿中，并用 100% 乙醇填充结晶皿。

因此，只需添加足够的乙醇来覆盖邮票的表面，但添加的乙醇的确切量并不重要。然后将结晶盘放入结晶器中，对印记进行超声处理 5 分钟。五分钟后，我们将完成邮票的消毒，并进行剩余的微接触打印，即在无菌组织培养罩中对 M 垫进行功能化。

所以现在我们在组织培养罩中，我们可以完成邮票的消毒。为此，我们从结晶皿中取出印章，将它们浸入装满乙醇的培养皿中以冲洗掉任何残留的碎屑，最后将它们浸入一盘水中以冲洗掉乙醇。然后，我们用一股氮气流，将邮票干燥，直到不再有可见的液滴残留。

所以下一步，我们必须用蛋白质溶液给邮票上墨。我们使用的蛋白质溶液是每密耳纤维蛋白 50 微克的 DEI 水溶液。只需在移液管中取一些蛋白质溶液，然后将蛋白质溶液滴到印章面上。

您希望通过在邮票表面的边缘放置小水滴来实现此目的。首先，对您将使用的所有邮票重复此作，我应该提前这样做。因此，在所有邮票的边缘放置点后，下一步是连接这些液滴并在邮票面上填充蛋白质溶液。

我们这样做的原因是，液滴和 sos 中的蛋白质溶液位于液滴下方，使邮票表面亲水性，从而更容易传播细胞外基质蛋白。所以，再一次，对你正在使用的所有邮票重复这个步骤，现在我们已经把蛋白质溶液涂在邮票的表面，给邮票上墨的最后一步是确保覆盖边缘。为此，我们只需调整移液管的角度并沿印章表面运行，以便您与 PDMS 印章的角和蛋白质溶液接触。

同样，对要墨迹的所有图章的所有边缘重复此作。现在我们完成了印章的上墨，我们设置了印章，我们将印章留在组织培养罩中一小时，以促进蛋白质完全吸收到印章表面。所以现在我们已经等待了一个小时让蛋白质储存起来，吸收到邮票表面，现在是时候用水冲洗它们并用氮气吹干了。

为此，我们取无菌水，然后将无菌水倒入装有邮票的培养皿中。小心不要将水直接倒在印章面上，如果需要，您可以使用移液器。只要您将水的液位保持在蛋白质溶液以上，您拥有的确切水量并不重要。

在此之后，用无菌镊子取一个邮票，将其浸入新盘水中，然后用氮气轻轻吹干。同样，当你看到邮票上不再看到蛋白质溶液的液滴时，你就会知道它是干燥的。然后对一次处理一个的所有图章重复此作。

所以现在我们已经把邮票冲洗干了，是时候通过用紫外线臭氧处理来激活 mpad 基材了。七分钟后，我从培养皿的顶部取下培养皿的盖子。因为你，因为聚苯乙烯是紫外线吸收剂，所以我然后把盘子放进紫外线臭氧处理机里，关上抽屉，把时间定为七分钟，然后放手。

所以现在我们回到了组织培养罩，是时候对刚刚用紫外线臭氧处理的 mpad 底物进行冲压了。为此，请用镊子提起我们冲洗和干燥的邮票。您可以处理邮票的侧面，但不要触摸邮票的表面。

您要调整镊子中的邮票，以便可以接触到蛋白质侧。然后，您将镊子倒置，请记住蛋白质侧向下，并慢慢使邮票与 eds 接触。1 到 30 个邮票非常粘，因此您可能需要使用第二对镊子才能从镊子中释放邮票。

您可以将邮票从大约 2 毫米的高度下降到大约 8 毫米到 emeds 上。然后将 emeds 的培养皿向上倾斜并用镊子轻轻向下按压，以便在邮票和 eds 之间产生接触。您将通过以下两种方式之一知道何时进行联系。

首先是通过邮票的侧面观察 ED 表面。这在相机上可能很难看到，但通过邮票的侧面观察表面，我可以清楚地看到邮票正在与表面接触。确保接触的第二种方法是与 p 接触，是将培养皿从组织培养罩中取出，盖上盖子，并在倒置显微镜下观察。

通过使用显微镜观察干涉图案，您应该能够判断邮票何时、是否以及何时与 eds 接触。一旦确定了接触，印章只需要与该印章保持接触，与 ed 基材保持几秒钟的接触。所以现在是删除邮票的时候了。

为此，请用一把镊子将 Eds 折叠起来，然后以一个流畅的动作撕下邮票。请务必跟踪您盖章的 eds 以及您之前已经使用过的邮票。并针对您希望使用的每种底物在每个 EMPA 重复一次此过程。

现在我们已经盖章了 EMPA，下一步是对其进行消毒，然后在称为 dye eye 的亲脂性染料中孵育它们。Dai 是一种带有荧光标记的亲脂性分子，因此它会在定时过程中扩散到 PDMS 中，使我们能够在显微镜下观察后偏转。所以我要做的是一次取一个单独的 empa 底物，并将其浸入 100% 乙醇、70% 乙醇 DI 水、DI 水、DI 水、DI 水中。

最后，每密耳 5 微克的 dii 溶液。DII 溶液是荧光的，因此为了尽量减少其暴露在环境光下并最大限度地减少其光漂白，我们在培养皿中孵育一小时时用铝箔覆盖培养皿。现在我们已经等待了一个小时让 EM 垫在 DAI 溶液中孵育，我们可以去除铝箔并冲洗掉 DAI 溶液。

我们通过在无菌水中连续浸泡 3 次来冲洗干净，最后，我们浸入 0.2% onic F1 27 的溶液中。即每体积重量的 0.2%在所有浸泡步骤中，重要的是要尽量减少 EM 垫暴露在空气中的时间。这是为了防止损坏 ED 基材，特别是防止两个柱子相互塌陷。

0.2%onic F1 27 是一种由亲水域和疏水域组成的三嵌段共聚物。已知亲水结构域抵抗蛋白质吸收，从而抵抗细胞粘附，而疏水结构域与回火结合，从而抵抗疏水 PDMS。因此，当 PDMS 浸泡在 F1 27 中时，F1 27 与 PDMS 结合并排斥细胞粘附。

在铝箔覆盖的培养皿中在慢性 F1 27 中孵育 1 小时后，我们可以通过在无菌水、无菌水和 PBS 中连续浸泡来冲洗 F1 27。浸泡在 PBS 中并且产品 F1 27 被冲洗掉后，我们可以将底物 eds 浸入所选的细胞培养溶液中。我刚刚将 EMPA 浸入的细胞培养液中可能含有血清和/或其他生长因子和/或补充剂，例如青霉素和链霉素。

所有这些成分都与 EMPAs 治疗完全兼容。现在，一旦 eds 浸入细胞培养溶液中，下一步就是将所选细胞接种到 eds 上。对于这个特殊的实验设置，我将牛肺主动脉内皮细胞接种到三个不同的培养皿中。

我使用三个不同培养皿的原因是，我将用已知的触觉抑制剂处理其中两个培养皿，以抑制柱子的偏转，因为我们稍后将能够进行分析。因此，为了接种细胞，我只需取细胞悬液，将适量吸入移液管中，然后逐滴移到每个培养皿中。我添加了足够的细胞，这样当我进行检测以测量牵引力时，细胞在 eds 上以单细胞形式存在。

您添加的量将取决于扩散面积以及特定细胞的生长速率。我们通常每平方厘米的底物接种 1500 到 5， 000 个细胞。完成细胞接种或编辑细胞悬液后，沿正交方向缓慢地来回摇动培养物数次，以将细胞悬液混合到培养皿中。

对正在使用的所有基材重复此过程。接种细胞后，立即将它们置于 37 度的培养箱中，并含有适当的二氧化碳，以缓冲 pH 值和细胞培养基。接种细胞后 2 小时，大约两小时，通过将底物从一培养皿培养基转移到相同细胞培养基的新鲜培养皿中来冲洗细胞是合适的。

这种冲洗的原因是大多数细胞已经开始扩散，并在两个小时内几乎达到其最终扩散区域。通过冲洗细胞和底物，您可以从细胞培养基中去除任何漂浮的细胞。这样，只有已经附着在 EDS 上并开始扩散过程的细胞才会显示在终点测定的牵引力。

我们可以对在 MPA 上培养的细胞进行的一种分析是延时成像，以定量检查细胞收缩力的动力学。特别是，响应可溶性因子的细胞收缩动力学很有趣。已知生物化合物和合成化合物等可溶性因子会增加、减少或对细胞收缩力产生未知影响。

对于这个活细胞实验，我们将使用这种倒置落射荧光显微镜。在显微镜载物台上，我有一个小的培养箱，已经连接到一个热调节器上，以将温度保持在 37 摄氏度，含 5% CO2。我们将使用 60 倍平面 APO 物镜进行高放大倍率成像。

现在我们将准备用于成像的冲击基材。我们用于成像的 60 倍物镜的工作距离为 200 微米，这比我们之前接种细胞的组织培养皿的厚度要薄得多。因此，我们不能，我们不能在组织培养皿中对植入物上的细胞进行成像。

为了解决这个问题，我们使用这些玻璃底培养皿。现在，我将把基板倒置到玻璃底培养皿中，使细胞和柱子的尖端位于玻璃底培养皿的界面处。因此，当将其放置在显微镜上时，细胞与物镜之间的工作距离小于 200 微米。

现在我们准备好将其放在显微镜上进行成像。现在，我打开活细胞培养箱，将样品放入其中，然后盖上培养箱盖。此时，我将扫描衬底以寻找合适的细胞。

要成像。最有效的方法是使用 Face Phase 1 10 x 物镜，这将使我能够看到更宽的基底视野并更快地找到细胞。我对 good cell 的标准是单个 cell。

它不应该接触任何相邻的细胞，并且与基质上的所有其他细胞相比，它的大小也应该处于平均水平，我找到了一个合适的细胞来观察。接下来我要做的是将物镜切换到 60 倍，以高倍率观察细胞。为此，我们使物镜散焦，这样就不会在旋转过程中碰撞舞台。

在旋转转塔时打开腔室，部分旋转 60 x 物镜 60 x 60 x 物镜是油浸透镜，因此我们必须在物镜上滴一滴浸油。现在我们将完成旋转 turt 以将 60 x 移动到位。我们将关闭培养箱室并重新聚焦物镜，使细胞重新聚焦。

微调细胞的位置和焦距后，我将切换到 CCD 相机，以便在计算机屏幕上预览细胞，然后开始延时成像。在这个实验中，我将以 1 分钟的间隔收集相位和荧光图像，因此延时成像已经开始，我将让它运行 10 分钟或 10 帧，此时我将添加血清 10 分钟已经过去了。这时，我会打开腔室，在培养皿中加入血清，以刺激细胞内的收缩力。

计时器仍在运行，所以我必须快速执行此作 现在，我们将继续对细胞进行成像 30 分钟，以跟踪收缩力的任何变化。完成延时成像后，可以将图像排序为显示的电影。这是相位和荧光图像的两部电影。

左侧是 a 的相位电影，一个几乎透明的单元格，以黑色轮廓勾勒。该单元分布在 20 个柱子的尖端，这些柱子是排列在矩形晶格中的圆形结构。右侧是同一单元格的荧光电影，但只有帖子可见。

如果我播放这些电影，你会看到连接到单元的柱子最初很弱，def 偏转，并且与矩形晶格的偏差很小。在电影的中间，我在媒体中添加了血清。血清刺激细胞增加收缩力。

当单元对下面的柱子施加更大的牵引力时，沿着单元周边的柱子开始向内偏转。在荧光电影中，您现在可以看到帖子明显偏离了它们在矩形晶格中的位置。正如我稍后将描述的那样，这些图像中这些柱位置的位移可用于分析该单元的牵引力。

之前，我们了解了如何生成 mpad 底物以及如何对其进行功能化以培养细胞。现在您可能已经注意到，我将完成的 mpad 底物放入三个不同的细胞培养皿中。细胞已经生长了一夜，现在我要做的是用不同的可溶性试剂处理每个单独的细胞培养皿，这种试剂以已知的方式调节收缩力。

然后，我们可以定量测量固定电池 30 分钟后产生的牵引力。在添加收缩抑制剂 30 分钟后添加可溶性因子后，现在是时候用多聚醛固定细胞以锁定当前的牵引力状态了。为此，使用含有钙和镁的多聚醛很重要，我们使用体积百分比为 3.7% 的多聚醛将基材浸入多聚醛中的方法，对不起，与将基材浸入其中的方法相同，在功能化过程中位于不同的 RIN 中。

也就是说，重要的是不要让基材变干，因为这可能会导致后塌陷。转移后，我已经转移了基材，让它们在多聚醛中孵育 20 分钟。20 分钟后，我们现在从多聚甲醛中去除底物，现在细胞已经固定，我们可以处理这些样品进行标准免疫染色。

为此，我们将底物正面朝上放在 param 上，并在足够的 PBS 上移液以覆盖底物并将其保持在 PBS 下方。然后，我们用 PBS 冲洗底物 3 次，以去除培养物中可能残留的任何多聚醛。用 PBS 冲洗底物 3 次后，我们可以转移底物进行下游免疫染色。

我们通过用一把镊子处理底物并在免疫染色的第一步倒置来实现这一点，这就是渗透剂。在本例中，我们在 PBS 中使用 0.2% Triton X。但是，用户可以使用最适合其需求的任何化代理。

我们对所有底物重复此作，这就是我们在 Immuno 染色过程中处理底物的方式。免疫染色后，将基底固定在 1 英寸 x 3 英寸的标准载玻片上，然后可以在任何落射荧光显微镜上进行处理，无论是倒置还是正置。通过在共聚焦显微镜上处理样品，我们可以聚焦在柱子的底部，以获得未偏转的零位置。

然后，我们可以专注于柱子的尖端，拍摄柱子的另一张图像，并且通过比较顶部和底部图像，我们可以测量柱子的挠度并计算单元产生的牵引力，这些单元为了产生这样的偏转。通过在几种不同条件下对许多不同的电池进行此过程，我们可以比较在不同条件下产生的牵引力。现在我们已经收集了活细胞和固定细胞的图像，或者下一个任务是测量挠度，测量细胞中的牵引力。

为此，为此，我们在 MATLAB 中编写了一个计算机程序。这是我们将在此分析中使用的三个图像。第一张图像是细胞的相位图像。

它有助于识别细胞的位置。第二张图片是柱子顶部的荧光图片。我们使用此图像来定位帖子在其尖端的位置。

如您所见，其中一些帖子偏转并偏离了大多数帖子所在的矩形格子，例如本文。还有这篇文章。我们将使用的第三张图像是基础图像，它捕获了柱子在 a、 处、 穿过其底部的焦平面上的位置。

在此级别，偏转和未偏转的柱子都应位于其静止位置、un、un 偏转位置。在矩形晶格中，你可以看到在第二张图片中在其底部偏转的柱子，它们处于 FL 位置。这张图片用于查找帖子的位置，它位于反射位置下。

接下来，我们加载 MATLAB 程序，它会提示我们加载这三张图片。为文件命名。您会看到相位图像。

我们将在周围画一个框来指示单元格的位置，这样程序就知道要分析哪些帖子。然后，该程序对裁剪图像进行强度、阈值和化，以确定帖子的 OID 坐标。左侧是顶部图像中帖子的 ized 图像，而右侧是来自基本图像的相同帖子的 ized 图像。

在获得柱子、OID 坐标后，程序可以确定每个柱子的尖端和底部之间的位移矢量。这些后位移矢量可以通过将它们乘以后柱的弹簧常数来转换为力矢量。我们可以通过多种方式分析这些细胞力，例如每个单元的平均力或每个柱子的平均力。

一个有用的结果是 Quiver 图，我们可以从中可视化力的空间分布。这是我们刚刚分析的单元格，你可以看到我在与力的大小相关的帖子上覆盖了黄色箭头，并指向力的方向。通过对序列图像（例如我们的延时电影中所需的图像）重复此图像分析过程，我们可以生成时间序列。

这是我们用血清刺激的细胞的电影。如您所见，就在添加血清时，细胞的收缩力增加并进一步偏转柱子。此外，我们可以量化更多经受不同条件然后固定染色的细胞的力，如这些颤动图所示，显示用对照化合物处理的细胞与用收缩抑制剂处理的细胞。

尽你所能。如您所见，在控制情况下，单元上 ， in 上的力矢量大于大小上的长度大于力矢量的长度。在使用收缩抑制剂的两种情况下，我们在这里介绍了许多材料材料，以描述从微制造到样品制备、实验和分析的路径基材，以证明这些基材的多功能性。

我们描述了两种不同的检测方法，即活细胞成像和固定样品检测，并且我们对从这两种检测中获得的细胞进行了分析，并展示了颤动图和颤动视频。有了这个强大的工具，人们可以对细胞收缩性进行各种空间和时间分析。如您所见，这种方法借鉴了许多不同的学科，包括微加工、基础细胞生物学、表面科学、图像分析和处理等学科。

正是因为它的方法基于几种不同的工程技术，所以可以根据用户的需求定制后几何形状、诱导的可溶性因子和分析后挠度的方法等参数。我们希望我们在过去 20 到 30 分钟内概述的这种方法的视觉演示可以作为其他和更深入分析细胞吸引力的调节、功能后果和产生的起点。