Name: 微阵列后探测器（mPADs）:机械力的方法来隔离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T12:10:27.000+00:00
Duration: 61 min 34 s
Description: 了解使用微阵列后探测器（mPADs）测量细胞收缩力的方法。该技术通过PDMS弹性微柱阵列量化细胞牵引力，为研究细胞运动、组织发育和伤口愈合中的力学机制提供重要工具。

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硅模板模具的制备 光刻 材料：
<ul>
<li>75 毫米硅晶圆</li>
<li>SU-8 2 负性光刻胶（Microchem，美国马萨诸塞州波士顿）</li>
<li>N2</li>
</ul>
方法：
<ol>
<li>将硅片在 120 °C 下脱水 2 小时。</li>
<li>对表面进行 7 分钟紫外臭氧处理，以去除有机物。</li>
<li>用氮气吹扫表面，以去除颗粒物。</li>
<li>涂覆 SU-8 2，覆盖约 70% 的表面（75 mm 硅片约需 10 ml）。</li>
<li>以 300 rpm/s 的加速度在 2000 rpm 下旋转 20 秒。</li>
<li>将硅片置于加热板上，从室温逐步升温至 95 °C。</li>
<li>在 95 °C 下对光刻胶进行 15 分钟前烘。</li>
<li>在 365 nm（I 线）下以 20 - 25 mJ/cm² 剂量进行泛光曝光，形成底层。</li>
<li>涂覆 SU-8 2 作为第二层光刻胶。</li>
<li>以 300 rpm/s 的加速度在 550 rpm 下旋转 20 秒，形成厚度约为 11 μm 的薄膜。</li>
<li>将硅片置于加热板上，从室温逐步升温至 65 °C。</li>
<li>在 65 °C 下对硅片进行 5 分钟前烘。</li>
<li>将加热板温度从 65 °C 逐步升至 95 °C。</li>
<li>在 95 °C 下对硅片进行 55 分钟前烘。</li>
<li>将硅片冷却至室温，持续 20 分钟。</li>
<li>将 mPAD 掩模对准硅片，并在 365 nm（I 线）下以 95 - 100 mJ/cm² 剂量进行曝光。</li>
<li>将硅片置于加热板上，从室温逐步升温至 95 °C。</li>
<li>在 95 °C 下对光刻胶进行 25 分钟曝光后烘烤。</li>
</ol>
制备 材料：
<ul>
<li>100毫米玻璃培养皿（5个）</li>
<li>丙二醇甲醚醋酸酯（PGMEA）</li>
<li>异丙醇（IPA）</li>
<li>N2</li>
</ul>
方法：
<ol>
<li>在通风橱中，用 PGMEA (2)、异丙醇（IPA）和正己烷（Hexane）(2) 分别填充五个培养皿。</li>
<li>将晶圆置于第一份 PGMEA 中 10 秒。</li>
<li>振荡晶圆 50 秒。</li>
<li>利用 PGMEA 的弯月面将晶圆转移至第二份 PGMEA 中。</li>
<li>振荡 5 秒。</li>
<li>利用 PGMEA 的弯月面将晶圆转移至异丙醇（IPA）中。</li>
<li>振荡 20 秒。</li>
<li>将晶圆转移至第一份异丙醇（IPA）中。</li>
<li>振荡 5 秒。</li>
<li>将晶圆转移至第二份异丙醇（IPA）中。</li>
<li>振荡 5 秒。</li>
<li>利用异丙醇（IPA）的弯月面迅速将晶圆从第二份 IPA 中取出，并用氮气（N₂）吹干。</li>
<li>检查图案。</li>
<li>在 120 °C 下对晶圆进行 14–20 小时的硬烘烤，以交联 SU-8。</li>
<li>使用金刚石切割器切割晶圆。</li>
<li>使用环氧树脂将晶圆固定在玻璃载片上。</li>
<li>对晶圆进行氟硅烷化处理（参见复制模塑中的说明）。</li>
</ol>
mPADS 的复制模塑 负模 材料：
<ul>
<li>一次性铝制称量皿</li>
<li>聚二甲基硅氧烷（PDMS）基础剂与固化剂（Dow，Midland，MI）</li>
<li>刀片</li>
<li>硅烷：(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)-1-三氯硅烷</li>
<li>载玻片</li>
<li>玻璃巴斯德吸管</li>
</ul>
方法：
<ol>
<li>按重量比10:1混合PDMS，并在真空条件下脱气1小时，以去除气泡。</li>
<li>将硅胶母模放入铝舟中。</li>
<li>在铝舟内的母模上倒入50–60 g PDMS。</li>
<li>在真空条件下脱气30分钟，以去除气泡。</li>
<li>用快速氮气脉冲吹除PDMS表面滞留的气泡。</li>
<li>将铝舟放入对流烘箱中，在110 °C下加热15分钟，直至PDMS固化。</li>
<li>剪去铝舟。</li>
<li>用剃刀刮除硅胶母模下方多余的PDMS。</li>
<li>沿单一方向缓慢且持续地将PDMS从硅胶母模上剥离，以避免损坏母模。</li>
<li>检查硅胶母模是否受损。</li>
<li>将负模切割成4块。</li>
<li>重复步骤1–10，制备大量负模。</li>
<li>对负模进行1.5分钟的氧气等离子体处理以活化表面，或</li>
<li>对负模进行10分钟的臭氧处理以活化表面。</li>
<li>将负模放入干燥器中，使mPAD结构面朝上暴露。</li>
<li>在干燥器中心的玻璃载片上滴加250–500 μL硅烷。</li>
<li>将尖端含有150–200 μL硅烷的玻璃巴斯德吸管置于干燥器内。</li>
<li>抽真空使硅烷蒸发，并对负模进行超过&gt;14小时的涂层处理。</li>
</ol>
mPADS 材料：
<ul>
<li>聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底 &amp; 固化剂（Dow，Midland，MI）</li>
<li>宽口一次性移液管</li>
<li>2” x 3” 玻璃载玻片</li>
<li>玻璃记号笔</li>
<li>N2</li>
</ul>
方法：
<ol>
<li>按重量比10:1混合PDMS，并在真空条件下脱气1小时，以去除气泡。</li>
<li>将硅烷化处理的阴模放置成“十字”形。</li>
<li>用移液器将PDMS注入阴模中，确保微结构完全被覆盖，厚度达到1 mm。</li>
<li>静置30分钟，使PDMS中的气泡上升至表面。</li>
<li>在30分钟空闲时间内，用氮气流吹扫22×22 mm（No. 2）的玻璃盖玻片以去除灰尘。</li>
<li>对玻璃载片半片进行1.5分钟的氧气等离子体处理，以清洁并活化玻璃表面。</li>
<li>用短促的氮气脉冲吹除PDMS表面 trapped 的气泡。</li>
<li>用手轻轻将玻璃盖玻片的一边接触PDMS，等离子体处理过的面朝向PDMS，然后缓慢放下盖玻片，使PDMS与整个玻璃表面完全贴合，避免在盖玻片下方截留气泡。</li>
<li>将组装好的模具放入对流烘箱中，在110 °C下加热20小时，使其完全固化。</li>
<li>从烘箱中取出模具，使其冷却至室温。</li>
<li>用手握住玻璃载片顶部，从底部缓慢剥离阴模，从而释放出mPAD。</li>
<li>在显微镜下检查mPAD是否存在支柱塌陷现象。</li>
<li>每铸造四次后，通过等离子体和硅烷重新硅烷化模具。阴模在保持良好复制性能下的使用寿命约为6–20次。</li>
</ol>
将细胞接种到微图案化表面 压印 材料：
<ul>
<li>用于微接触印刷（uCP）的PDMS印章（参见 Tien, J &amp; Chen, C. S.，《组织工程方法》，2001年，第113-120页）</li>
<li>乙醇（100% 和 70%）</li>
<li>灭菌去离子水</li>
<li>无菌去离子水中配制的50 μg/mL人纤维连接蛋白（BD Biosciences）</li>
<li>经0.2 μm滤膜过滤的5 μg/mL DiI溶液（D-3886，Molecular Probes，OR）</li>
<li>2% Pluronics F127（BASF，Mount Olive，NJ）</li>
<li>1×磷酸盐缓冲液</li>
<li>100 mm × 25 mm 培养皿（4个）</li>
<li>150 mm × 25 mm 培养皿（2个）</li>
<li>铝箔</li>
<li>N2</li>
<li>镊子</li>
<li>无菌操作台</li>
</ul>
方法：
<ol>
<li>修剪微图案化PDMS芯片（mPADs）上多余的PDMS</li>
<li>若PDMS印章曾被使用过，需将其在100%乙醇中进行超声处理5分钟，以去除污染性蛋白质</li>
<li>在无菌操作台中，用镊子夹住印章侧面，先将其浸入新鲜的100%乙醇和无菌水中，随后用氮气（N₂）吹干</li>
<li>将印章放置于150 mm培养皿中，工作面朝上</li>
<li>将纤连蛋白溶液分装滴加至每个印章表面。先从每个印章的角落开始，然后是边缘区域，最后是内部区域。初始状态下PDMS表面具有疏水性，但随着蛋白吸附，表面逐渐变为亲水性。“由外向内”的操作方式可改变PDMS的接触角，从而减少完全覆盖印章所需的纤连蛋白溶液体积</li>
<li>在操作台中静置1小时，使蛋白充分吸附</li>
<li>通过向培养皿中倾倒去离子水（DI水）并使液面上升至完全覆盖印章的方式清洗印章</li>
<li>将印章转移至盛满去离子水的100 mm培养皿中进一步清洗</li>
<li>取出印章并用氮气（N₂）吹干</li>
<li>对mPADs进行7分钟臭氧处理，以活化表面便于后续印章转移</li>
<li>在通风橱内进行印章转移：将印章边缘接触mPAD表面，然后缓慢放下以确保完全贴合。用镊子轻轻敲击印章顶部，确保所有区域均良好接触，但需注意避免压塌微柱结构</li>
<li>用镊子小心取下印章</li>
<li>将mPADs浸入盛有100%乙醇的100 mm培养皿中约15秒。在转移过程中应迅速操作，防止微针结构发生脱湿现象</li>
<li>将mPADs浸入盛有70%乙醇的100 mm培养皿中约15秒</li>
<li>将mPADs浸入盛有去离子水的100 mm培养皿中约15秒</li>
<li>将mPADs浸入第二个盛有去离子水的100 mm培养皿中约15秒</li>
<li>将mPADs浸入盛有去离子水的150 mm培养皿中</li>
<li>将mPADs浸入盛有100 mL DiI溶液的150 mm培养皿中</li>
<li>用铝箔覆盖，浸泡1小时</li>
<li>将mPADs浸入盛有去离子水的100 mm培养皿中约15秒</li>
<li>将mPADs浸入盛有10 mL 2% Pluronics和90 mL PBS的150 mm培养皿中，最终Pluronics浓度为0.2%</li>
<li>盖上盖子，浸泡1小时</li>
<li>将mPADs浸入盛有去离子水的100 mm培养皿中约15秒</li>
<li>将mPADs浸入第二个盛有去离子水的100 mm培养皿中约15秒</li>
<li>将mPADs浸入第三个盛有PBS的100 mm培养皿中约15秒</li>
</ol>
接种 材料：
<ul>
<li>选定的细胞系</li>
<li>胰蛋白酶-EDTA（0.25% 胰蛋白酶含 EDTA•4Na，Gibco 货号 25200-056）</li>
<li>生长培养基</li>
<li>1× 磷酸盐缓冲液</li>
</ul>
方法：
<ol>
<li> 在无菌操作台中，将 mPADS 置于 100 mm 培养皿内，并加入 17 mL 培养基。 </li>
<li> 将培养皿放入培养箱中，使其升温至 37°C </li>
<li> 使用胰蛋白酶悬浮细胞 </li>
<li> 反复吹打以分散细胞团块。 </li>
<li> 将细胞悬液转移至含有 mPADS 的培养皿中。添加细胞时应确保在分析时细胞保持为单细胞状态（无细胞间接触）。所需添加的细胞数量因细胞类型而异，取决于细胞的铺展面积和生长速率。 </li>
<li> 通过缓慢移液轻轻分散培养皿中的细胞。 </li>
<li> 将培养皿放入培养箱中孵育 2 小时，使细胞沉降并黏附到微针上。 </li>
<li> 检查 mPADS 上的细胞是否已铺展。铺展的细胞将呈现扁平形态，并跨越六个或更多微柱。 </li>
<li> 若细胞已铺展，将 mPADS 转移至新的 100 mm 培养皿中，并加入 21 mL 新鲜培养基。 </li>
<li> mPADS 现已准备好用于实验。 </li>
</ol>
mPADS 染色与封片 固定 材料：
<ul>
<li>去离子水</li>
<li>多聚甲醛（16%）小瓶</li>
<li>10× 磷酸盐缓冲液</li>
<li>1× 磷酸盐缓冲液</li>
</ul>
方法：
<ol>
<li> 在一个 50 mL 离心管中，加入 30 mL 去离子水、10 mL 多聚甲醛（整瓶）和 4.5 mL 10X PBS，配制固定液。 </li>
<li> 将约 25 mL 固定液加入一个 100 mm 培养皿中。</li>
<li> 轻轻将带有细胞的 mPAD 浸入固定液中，室温孵育 20 分钟。</li>
<li> 将 mPADs 放入含 1X PBS 的 100 mm 培养皿中，清洗三次。</li>
<li> 即可进行免疫染色和封片。 </li>
</ol>
分析细胞在mPADS上的受力 共聚焦成像 材料：
<ul>
<li>共聚焦显微镜</li>
<li>63倍物镜</li>
<li>用于二抗的滤光片组</li>
<li>绿色滤光片组（罗丹明），用于微针DiI成像。</li>
</ul>
方法：
<ol>
<li> 将 mPADs 放置在载物台上，使用 300 ms 曝光时间、无像素合并的方式寻找单个细胞。</li>
<li>对微针顶部成像以获取顶部图像（TOP IMAGE）。</li>
<li>利用 z 轴控制读数，对微针进行成像以获取底部图像（BOTTOM IMAGE）。</li>
<li>对其他任何有染色的通道（如 Hoechst、鬼笔环肽等）进行成像。</li>
</ol>
图像分析 材料：
<ul>
<li>配备图像处理工具箱的 MATLAB</li>
</ul>
方法：
<ol>
<li>旋转并对齐顶部和底部图像</li>
<li>测量底部（未偏转）和顶部（偏转）位置的质心</li>
<li>计算位移</li>
<li>利用已知的微柱弹簧常数（取决于微柱几何形状），计算每个微柱上的力矢量</li>
<li>误差分析基于力的分辨能力，取决于图像分辨率和质心检测分辨率</li>
<li>根据自定义需求整理数据——例如，力的大小和/或方向、随时间变化的过程、在不同条件下进行的多次测量等</li>
</ol>

<ol><li>Tan, J. L., Tien, J., Pirone, D., Gray, D. S., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+lying+on+a+bed+of+microneedles%3A+An+approach+to+isolate+mechanical+force%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 100, 1484-1489 (2003).</li>
<li>Sniadecki, N. J., Chen, C. S. Microfabricated Silicone Elastomeric Post Arrays for Measuring Traction Forces of Adherent Cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSniadecki%2C+NJ+%22Methods+in+Cell+Biology+-+Cell+Mechanics%22">Methods in Cell Biology - Cell Mechanics</a>. Wang, Y. L., Discher, D. E. 83, Elsevier. New York. 313-328 (2007).</li>
<li>Lemmon, C. A., Sniadecki, N. J., Ruiz, S. A., Tan, J. T., Romer, L. H., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+Force+at+the+Cell-Matrix+Interface%3A+Enhanced+Analysis+For+Microfabricated+Post+Array+Detectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanics+%26+Chemistry+of+Biosystems%22%5BJournal%5D)">Shear Force at the Cell-Matrix Interface: Enhanced Analysis For Microfabricated Post Array Detectors.</a> Mechanics & Chemistry of Biosystems. 2, 1-16 (2005).</li>
</ol>

微加工柱阵列检测器（mpads）：一种分离力学力的方法

Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces

在本视频中，我们将介绍利用微加工柱阵列测量细胞牵引力的方法。牵引力由肌球蛋白与肌动蛋白的相互作用产生，在生理过程中发挥重要作用。在发育过程中，牵引力促使细胞从一个位置移动到另一个位置，以形成组织的早期结构。牵引力有助于机体的修复过程，对于伤口的正常闭合以及白细胞在体内的迁移和爬行至关重要。然而，在癌症转移或肿瘤周围血管生成的情况下，这些相同的力可能对健康造成不利影响。目前体外研究细胞最常用的方法是使用玻璃或聚苯乙烯培养皿。然而，这类基底刚性过高，无法直接测量细胞的牵引力，且可用于研究牵引力的方法相对有限。我们实验室开发了一种技术以克服这些局限。该方法基于垂直排列的柔性悬臂柱阵列，其刚度和尺寸尺度使得单个细胞可铺展于多个悬臂柱上，并在过程中使其发生偏转。我们所使用的柱体直径为3 μm，高度为10 μm，呈规则排列，柱心间距为9 μm。但这些物理参数可根据不同研究需求灵活调整。我们以硅模板为起始材料，最终的柱体由一种名为聚二甲基硅氧烷（poly(dimethyl siloxane)，PDMS）的硅橡胶制成。通过显微镜可测量柱体的偏转程度，并据此计算产生该偏转所需的牵引力的大小和方向。我们将这类基底称为微加工柱阵列检测器（microfabricated post-array-detectors，mPADs）。接下来，我们将展示如何制备和使用mPADs来评估细胞收缩力的调控变化。

微加工柱阵列检测器，细胞牵引力，PDMS，细胞收缩力，悬臂柱，肌动蛋白-肌球蛋白，细胞迁移，伤口愈合，癌症转移，血管生成

在本视频中，我们演示如何制备和使用微加工柱阵列检测器（mPADs）来评估细胞收缩力的调节情况。

微加工柱阵列检测器（mPADs）：一种分离力学力的方法

在本视频中，我们将介绍利用微加工柱阵列测量细胞牵引力的方法。细胞牵引力由细胞...

大家好，我是Nathan Snia Decky，今天和我一起的有Wes Ligan、Robbie Desai以及Mike Yang。我们来自宾夕法尼亚大学Chris Chen实验室。在本视频中，我们将介绍一种利用微加工柱阵列来测量细胞吸引力的方法。牵引力由肌球蛋白与肌动蛋白的相互作用产生，在生理过程中发挥着重要作用。在发育过程中，这些力使细胞能够从一个位置移动到另一个位置，从而形成组织的早期结构。此外，牵引力还参与愈合过程，因为它们对于伤口闭合以及白细胞在体内的迁移和爬行至关重要。但遗憾的是，在癌细胞转移或血管向肿瘤生长的情况下，这些相同的力可能对我们的健康造成损害。因此，目前能够用于定量测量这些牵引力的方法非常有限，尤其是在单个细胞的微米和纳米尺度上。目前大多数体外研究细胞的常用方法都使用玻璃底培养皿或聚苯乙烯培养皿，但这些基底非常刚性，无法让我们实际测量细胞所产生的牵引力及其引起的形变。因此，如果没有某种物理读出手段，要理解牵引力的潜在机制一直非常困难。为此，在Chris Chen的实验室中，我们开发了一种技术，能够克服这些局限性。我们的方法基于一种垂直排列的柔性悬臂阵列，其刚度和尺寸尺度使得单个细胞能够铺展在多个悬臂上，并在过程中使其发生偏转。我们最常使用的尺寸为直径3微米、高10微米的圆柱形微柱，中心间距为9微米，呈矩形阵列排列。然而，这些尺寸可根据多种细胞研究的需求进行调整。我们首先从一个刚性硅模板开始（如图所示），然后将其转化为柔性的PDMS悬臂梁（如图所示）。利用该技术，我们可以在显微镜下测量各个悬臂梁的偏转，并反推出产生此类偏转所需的细胞牵引力的大小和方向。我们将这些基底制成了用于微柱阵列检测器的 M 垫片，在本视频中，我们将向您展示 M 垫片的制备过程，从硅胶母模开始，经过 PDMS 复型，最终实现调制和细胞收缩力的计算。您好，我们现在位于实验室的洁净室内。这是一个无尘且避光的环境，用于制备将作为硅模板的SU-8微柱结构。我们首先采用一片硅片，并在其表面涂覆SU-8光刻胶。SU-8是一种负性光刻胶，具有光敏性。因此，当光线透过光刻掩模照射时，会在光刻胶上形成微柱图案，进而生成三维结构，即后续用于PDMS复制的SU-8模板。完成所有加工步骤后，晶圆将呈现如图所示的形貌，即微柱和微柱状结构已加工到晶圆上。为了制作母版，我们首先从一片洁净的硅片开始，该硅片已用臭氧处理清洗七分钟，并在120摄氏度下脱水处理30分钟。接下来，我们将SU-8 2002光刻胶旋涂到该硅片上，以形成用于微柱的极薄基底层。由于我们将要旋涂SU-8，所以我将佩戴防毒面具，将晶圆重新装入此卡盘中，清除表面可能存在的灰尘，然后将其放置在旋涂仪上，检查是否居中，接着将SU-8 2002溶液滴加到晶圆表面，随后开始旋涂。旋涂完成后，将晶圆转移至加热板上进行软烘。之后我们继续操作一分钟

microfabricated-post-array-detectors-mpads-an-approach-to-isolate

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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