Name: 人类诱导多能干细胞的转染和Nucleofecting (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 学习人类诱导多能干细胞的转染和核转染优化方案，建立无饲养层培养体系，实现高效率基因操作并最小化细胞死亡，为再生医学研究提供可靠的转基因iPSC细胞系构建方法。

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本手稿中描述的研究工作由加州再生医学研究所（CIRM）为加州大学河滨分校干细胞核心实验室提供资金支持。

本方案首先介绍将人诱导多能干细胞（iPSCs）适应于无饲养层培养的方法，随后介绍使用GeneJuice（EMD）转染人iPSCs以及利用AMAXA核转染仪对人iPSCs进行核转染的实验步骤。
注意：以下操作均在无菌超净工作台中进行。除另有说明外，所有培养基和溶液在使用前均需平衡至37°C或室温。
1. 在无饲养层系统中建立人诱导多能干细胞
先前在饲养细胞上培养的人iPSCs可在传代后转移至Geltrex包被的培养皿中，并在无饲养细胞条件下传代培养两代，随后进行无饲养层转染。
<ol>
	<li>在4°C条件下过夜解冻Geltrex。为制备Geltrex包被液，将解冻后的Geltrex用冷DMEM按1:50比例稀释，轻轻混匀溶液。</li>
</ol>
注意：Geltrex 与 Matrigel 类似，是一种从小鼠 Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）肿瘤细胞中纯化的基底膜基质的可溶性形式。此外，Matrigel 也可用作细胞外基质，用于建立无饲养层的人诱导多能干细胞（iPSC）培养体系。
<ol start="2">
	<li>用Geltrex溶液覆盖培养孔的整个表面（35 mm孔使用1 ml）。在37°C培养箱中孵育1小时，使孔表面完成Geltrex包被。</li>
	<li>传代人iPSC时，每孔加入1 ml的accutase，于37°C孵育1分钟，直至大多数细胞开始脱落。</li>
</ol>
传代人iPSC时，每孔加入1 ml的accutase，于37°C孵育1分钟，直至大部分细胞开始脱落。
<ol start="4">
	<li>向细胞中加入10-15颗玻璃珠，轻轻摇晃培养板。加入2 ml KnockOut DMEM/F12，轻柔吹打混匀。将细胞悬液转移至10 ml离心管中。</li>
	<li>在室温下以800 rpm离心3分钟。</li>
	<li>吸除上清液，保留人iPSC沉淀。轻弹离心管使细胞沉淀重新悬浮。</li>
	<li>移除包被孔中的Geltrex。</li>
	<li>用适量体积的STEMPRO培养基轻柔重悬人iPSC沉淀，根据增殖速率将其分配至饲养层的不同孔中。人iPSC可按1:2至1:6的传代比例进行传代。</li>
	<li>小心放入5% CO2培养箱中，轻柔摇晃培养板以确保细胞在各孔中均匀分布。</li>
	<li>每天更换培养基，直至细胞再次准备传代（当细胞达到80%融合度时）。</li>
	<li>将人iPSC以1:2的传代比例传代至新的Geltrex包被孔中（步骤1.3至1.9）。在转染前，应形成较小的克隆并均匀分布在Geltrex包被的孔中。</li>
</ol>
2. 使用 GeneJuice 转染人iPSC
转染当天，细胞（在6孔板中培养）的融合度应约为40–50%，以达到最佳转染效率。在转染后的第二天之前，无需更换细胞培养基。
<ol>
	<li>在无菌的1.5 ml离心管中准备100 μl KO-DMEM/F12。加入27 μl GeneJuice转染试剂，充分混匀。室温孵育5分钟。</li>
	<li>加入4 μg质粒DNA，室温孵育15分钟。质粒的选择对获得最佳转染效率至关重要。我们使用由CAG启动子驱动增强型绿色荧光蛋白（eGFP）表达的质粒5（pCAG-eGFP）。CAG启动子是一种强启动子，在人诱导多能干细胞（iPSCs）中具有转录活性，因此可用于驱动这些细胞中外源基因的表达。据我们观察，质粒线性化似乎不影响转染效率。</li>
	<li>将GeneJuice-DNA混合物加入细胞中并轻轻摇晃培养板。以1200 rpm离心5分钟（“旋转感染”法），以增加转染混合物与孔中人iPSCs的接触。</li>
	<li>将细胞在37°C下孵育过夜。</li>
	<li>次日观察转染效率。</li>
	<li>对于稳定转染，次日更换为新鲜的STEMPRO培养基，并在24–48小时后加入适当的抗生素进行筛选。</li>
</ol>
3. 人类iPSC的核转染
在饲养层细胞或Geltrex上培养的人iPSC可用于核转染。然而，我们强烈建议将核转染后的人iPSC重新接种至小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）或人包皮成纤维细胞（HFF）饲养层上，以确保较高的细胞存活率和恢复能力。为在核转染后获得较高的细胞存活率，至少应使用200万个细胞。
<ol>
	<li>通过将人iPSC KnockOut血清替代物（KOSR）培养基与饲养细胞共同孵育过夜来制备饲养细胞条件培养基（CM）。每24小时收集一次CM。</li>
</ol>
注意：用于制备饲养层的任何小鼠品系（如 BLK6、CF1 和 MF1）均适用于制备条件培养基（CM）。
<ol start="2">
	<li>在核转染当天，用 10 μM ROCK 抑制剂预处理人诱导多能干细胞至少 1 小时。</li>
	<li>在无菌的 1.5 ml 离心管中配制 82 μl 人干细胞核转染溶液，加入 18 μl 辅助剂 1，充分混匀，于 37°C 孵育 5 分钟。</li>
	<li>将饲养细胞条件培养基（CM）和 0.25% 胰蛋白酶/EDTA 预热至 37°C。在超净台内，预先标记一个无菌的 15 ml 尖底离心管。</li>
	<li>小心移除待进行核转染的人诱导多能干细胞培养物中的培养基，每孔用 2 ml 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）轻柔洗涤细胞一次，吸除 PBS。每孔加入 1 ml 0.25% 胰蛋白酶，于 37°C 孵育 3 分钟。</li>
	<li>用 1000 μl 移液枪头轻柔吹打细胞，冲洗孔底以确保所有人诱导多能干细胞完全脱落，将细胞悬液转移至已标记的 15 ml 尖底离心管中。</li>
</ol>
注意：应严格避免将细胞消化成单细胞。细胞仅需被分离成由大约三个细胞组成的细胞小团。在后续细胞操作过程中，这些细胞小团（细胞三联体）将被进一步解离为单细胞。
<ol start="7">
	<li>加入 9 ml MEF 培养基以灭活胰蛋白酶。在 800 rpm 条件下离心 3 分钟。小心吸除上清液，保留细胞沉淀完整。</li>
	<li>用预热的 100 μl 人干细胞核转染溶液（来自步骤 3.3）重悬细胞。</li>
	<li>使用 1 ml 移液器吸头将细胞转移至核转染杯中。</li>
	<li>向核转染杯中的细胞悬液加入 4 μg 质粒 DNA。通过轻轻旋转混匀细胞与 DNA。将核转染杯在生物安全柜表面轻敲两次。</li>
	<li>将核转染杯插入核转染仪的样品槽中。选择程序 B-016，按下按钮 X 进行核转染。</li>
</ol>
当核转染过程完成时，将显示&lt;<ok>&gt;（通常仅需1-5秒）。使用其他核转染程序（A-023、A-033和U-023）从人iPSCs获得的eGFP阳性细胞比例低于10%。</ok>
<ol start="12">
	<li>使用提供的塑料巴斯德吸管从电穿孔杯中取出转染后的细胞。将细胞重悬于预热的CM培养基和ROCK抑制剂中，转移至无菌的1.5 ml离心管。于37°C孵育10分钟，使细胞恢复。</li>
	<li>用1 ml移液枪头将细胞逐滴转移至饲养层上。于37°C孵育过夜。</li>
	<li>次日观察转染效率。如需获得稳定表达外源基因的转基因人iPSC稳定克隆，于次日更换为含CM培养基和ROCK抑制剂的新鲜培养基。在24–48小时后加入适当的抗生素进行筛选。</li>
</ol>
4. 代表性结果：
<img alt="在相差显微镜和荧光显微镜下表达eGFP的细胞；显示表达水平的示意图。" src="/files/ftp_upload/3110/3110fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 转染pCAG-eGFP的Riv1人源iPSCs的显微照片。(A) 使用GeneJuice在Geltrex基质上转染12小时后表达eGFP的Riv1细胞。经核转染后，Riv1人源iPSCs在饲养层细胞上接种并形成克隆，分别使用B-016 (B) 和A-023 (C) 程序。(D) 通过GeneJuice转染获得的稳定表达eGFP的人源iPSC克隆，显示广泛性eGFP表达。(E) 稳定转染的Riv1人源iPSCs在拟胚体分化过程中维持组成型eGFP表达。

<ol><li>Liew, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells%3A+possibilities+for+human+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Med%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells: possibilities for human cell transplantation.</a> Ann Med. 37, 521-532 (2005).</li>
<li>Eiges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+embryonic+stem+cell-transfected+clones+carrying+a+marker+for+undifferentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells.</a> Curr Biol. 11, 514-518 (2001).</li>
<li>Zwaka, T. P., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogous+recombination+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Homogous recombination in human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 21, 319-321 (2003).</li>
<li>Siemen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Nucleofection of human embryonic stem cells.</a> Stem Cells Dev. 14, 378-383 (2005).</li>
<li>Liew, C. G., Draper, J. S., Walsh, J., Moore, H., Andrews, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+stable+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 25, 1521-1528 (2007).</li>
<li>Xia, X., Ayala, M., Thiede, B. R., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro-+and+in+vivo-induced+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells+and+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">In vitro- and in vivo-induced transgene expression in human embryonic stem cells and derivatives.</a> Stem Cells. 26, 525-533 (2008).</li>
<li>Braam, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+genetic+manipulation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells.</a> Nat Methods. 5, 389-392 (2008).</li>
<li>Braam, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+culture+of+human+embryonic+stem+cells+in+conditioned+medium+for+efficient+genetic+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Feeder-free culture of human embryonic stem cells in conditioned medium for efficient genetic modification.</a> Nat Protoc. 3, 1435-1443 (2008).</li>
<li>Hohenstein, K. A., Pyle, A. D., Chern, J. Y., Lock, L. F., Donovan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+mediates+high-efficiency+stable+gene+knockdown+and+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Nucleofection mediates high-efficiency stable gene knockdown and transgene expression in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 26, 1436-1443 (2008).</li>
<li>Placantonakis, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAC+transgenesis+in+human+embryonic+stem+cells+as+a+novel+tool+to+define+the+human+neural+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">BAC transgenesis in human embryonic stem cells as a novel tool to define the human neural lineage.</a> Stem Cells. 27, 521-532 (2009).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

我们的实验方案能够以简单、稳健且高度可重复的技术将外源基因导入人iPSC中，且无明显毒性作用和细胞死亡。人iPSC应以较小的细胞团块（5–10个细胞）传代，并以高密度（1:2）接种于Geltrex基质上，以确保在大量小克隆中实现最佳转染效率。对于更容易发生分化和细胞死亡的人iPSC细胞系，单次核转染实验应使用更多数量的人iPSC（最多4 × 106个细胞）。瞬时转染实验可在1天内产生大量表达外源基因的人iPSC。稳定转染的iPSC克隆通常在7天内出现，这些转基因克隆应在三周内准备好进行挑取。此处所述的CAG启动子可确保eGFP报告基因的广泛表达。通过这些改进，本实验方案可进一步应用于其他研究领域，包括基因过表达、条件性诱导、谱系特异性报告细胞系的建立、shRNA或siRNA介导的基因沉默、基因靶向以及同源重组。

<table><tbody><tr><td>0.25% 胰蛋白酶含 EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基&amp;#8211;乙醇</td><td>Invitrogen</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>3 mm 玻璃珠</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-312A</td><td>玻璃珠应使用盐酸（HCl）浸泡过夜，再用氢氧化钠（NaOH）和蒸馏水冲洗，并在使用前通过高压灭菌进行消毒。</td></tr><tr><td>Accutase 细胞解离试剂</td><td>Invitrogen</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0263</td><td></td></tr><tr><td>DMEM（高糖）</td><td>Lonza Inc.</td><td>12-741 F</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Invitrogen</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Invitrogen</td><td>12760013</td><td>生长因子减少型</td></tr><tr><td>GeneJuice 转染试剂</td><td>EMD Millipore</td><td>70967</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax-I（100X）</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td>也可使用 L-谷氨酰胺（Invitrogen，25030081）替代。</td></tr><tr><td>人诱导多能干细胞 KOSR 培养基</td><td></td><td></td><td>500 ml 人胚胎干细胞培养基包含 390 ml KnockOut DMEM/F12、100 ml KnockOut 血清替代物、5 ml Glutamax-I（100X）、5 ml NEAA（100X）、500 &amp;#x03BC;l 2-巯基&amp;#8211;乙醇（55 mM），并补充 10 ng/ml bFGF。</td></tr><tr><td>KnockOut DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12660-012</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut 血清替代物（KOSR）</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>小鼠胚胎成纤维细胞培养基</td><td></td><td></td><td>MEF 培养基由 90% FBS、1X NEAA、1X Glutamax-I 和 1X 丙酮酸钠组成，溶剂为 DMEM（高糖）</td></tr><tr><td>非必需氨基酸 NEAA（100X）</td><td>Invitrogen</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>人干细胞核转染溶液 1 及其补充剂</td><td>Lonza Inc.</td><td>VAPH-5012</td><td></td></tr><tr><td>不含 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 的磷酸盐缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠（100X）</td><td>Invitrogen</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>STEMPRO 培养基试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>A1000701</td><td>500 ml STEMPRO 培养基包含 454 ml KnockOut DMEM/F12、10 ml STEMPRO 无血清生长补充剂（50X）、5 ml Glutamax-I（100X）、5 ml NEAA（100X）、36 ml BSA（牛血清白蛋白，25%）、909 &amp;#x03BC;l 2-巯基&amp;#8211;乙醇（55 mM），并补充 10 ng/ml bFGF。</td></tr></tbody></table>

转染和核转染人诱导性多能干细胞

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

基因改造技术在干细胞生物学研究以及人类胚胎干细胞（HESCs）潜在临床应用的探索中，持续发挥着关键作用1。尽管已有多种基因递送方法得到改进2-9，但转染对HESCs而言仍是一个不稳定的过程，而在人类诱导性多能干细胞（iPSCs）中，尚无转染成功的报道。在本视频中，我们展示了本实验室如何常规使用携带增强型绿色荧光蛋白（eGFP）报告基因的质粒对人类iPSCs进行转染和核转染。人类iPSCs以无饲养层条件培养并维持，以避免饲养细胞被转染，并在转染后高效筛选出稳定的转基因iPSC克隆。在核转染过程中，人类iPSCs首先用ROCK抑制剂预处理11，经胰蛋白酶消化形成小细胞团块，随后进行核转染，并接种于饲养细胞条件培养基中的饲养层上，以提高细胞复苏效率。转染后6小时即可获得表达外源基因的人类iPSCs。抗生素筛选在24小时后开始，稳定的转基因细胞系通常在1周内出现。本实验方案稳定且可重复，适用于人类iPSC系，且不会改变这些细胞的多能性。

尽管基因修饰技术已取得近期进展，人类胚胎干细胞（HESCs）的转染仍是一个不稳定的过程。据我们所知，目前尚未有报道关于系统性且高效转染人类诱导多能干细胞（iPSCs）的方法。本文中，我们描述了高效转染和核转染人类iPSCs的可靠方案。

基因修饰在研究干细胞生物学以及推动人类干细胞潜在临床应用方面，正持续发挥着关键作用。

本实验的总体目标是通过优化转染和核转染方案，在人诱导性多能干细胞中实现高效的转染效率。首先建立无饲养层培养的人诱导性多能干细胞体系，用于转染时，将人诱导性多能干细胞接种于明胶、TRX 或 matrigel 上过夜。对于核转染，通过胰蛋白酶获得小的细胞团块，将质粒DNA与基因转染试剂的混合物加入已铺板的细胞中，随后将培养板离心并在37摄氏度下孵育。人iPS细胞悬液在核转染装置中进行核转染处理，然后将细胞重悬于MEF条件培养基中，并在37摄氏度下孵育。最终可获得结果，显示在人iPS细胞中通过高转染效率实现了高效的基因操作。与先前描述的转染电穿孔和核转染等现有方法相比，该技术的主要优势在于，我们在实验室中能够常规实现人源iPS细胞的高效转染，并获得稳定一致的结果。我们的方案还能确保基因修饰后细胞死亡率最低。因此，该方案可实现转基因人源iPS细胞系的快速、大规模制备。在将人源诱导性多能干细胞适应无饲养层培养之前，需准备经gelt TRX包被的培养皿。接下来，将先前在饲养层细胞上培养的人类胰岛前体细胞（IPCs）用每孔1 mL的视黄酸（Accutane）进行处理，在37°C下孵育1分钟，直至大多数细胞开始脱落；向细胞中加入10至15颗玻璃珠，轻轻晃动培养板。然后加入2 mL knockout D-M-E-M-F12培养基，轻柔吹打混匀。将细胞悬液转移至10 mL离心管中。在室温下以800 RPM离心细胞3分钟。吸除上清液，保留人iPSC沉淀完整。轻轻弹击离心管以轻柔分散细胞沉淀。Reese，将人iPSC细胞沉淀重悬于适量的STEM pro培养基中，并分配至经gel TRE包被的培养板各孔中。根据增殖速率，人iPSC细胞可按1:2至1:6的传代比例进行传代。将培养板小心放入含5%二氧化碳、37°C的培养箱中，并轻轻旋转培养板，以确保细胞在各孔中均匀分布。每天更换培养基。当细胞融合度达到80%时，可再次传代至新的凝胶包被孔中。转染当天，按1:2的比例传代后，细胞融合度应约为40%至50%，并以较小的克隆形式均匀分布在凝胶包被的孔中，以获得最佳转染效率。开始此操作前，在无菌的1.5毫升离心管中准备100微升敲除培养基。加入27微升Gene Juice转染试剂，充分混匀，并在室温下孵育5分钟。接着，加入4微克质粒DNA。质粒的选择对于实现最佳转染效率至关重要。本实验所用质粒携带由CAG启动子驱动的增强型绿色荧光蛋白基因，该启动子是一种在人胰岛样细胞（IPCs）中具有强转录活性的启动子。将离心管于室温孵育15分钟。15 分钟后，将基因转染液和 DNA 混合物加入细胞中，并混匀培养板。以 1,200 RPM 转速离心 5 分钟，以增加转染混合物与孔中人源 IPC 细胞的接触。于次日将细胞在 37 摄氏度条件下孵育过夜。在转染当天监测转染效率，在人源诱导多能细胞（IPCs）进行核转染预处理前，用10 µM的ROCK抑制剂在37°C条件下预处理至少一小时。在无菌的1.5 mL离心管中准备82 µL人源干细胞核转染试剂溶液。加入80 µL。加入补充物一，并用移液器充分混匀。将溶液在37摄氏度下孵育5分钟。孵育前，将预先准备的饲养细胞条件培养基和含EDTA的0.25%胰蛋白酶预热至37摄氏度，在生物安全柜中进行。预先标记一个无菌的15毫升锥形管。小心移除拟进行核转移的人类iPSC培养物中的培养基，并用磷酸盐缓冲液轻轻洗涤细胞。吸除PBS，加入胰蛋白酶，在37摄氏度下孵育细胞3分钟。为了成功进行核转染，关键在于不要将细胞消化成单细胞。相反，应将细胞吹打成由两到三个细胞组成的小细胞团。使用 P 1000 移液枪头轻轻吹打细胞，使其形成由两到三个细胞组成的小细胞团。通过反复吹打洗涤孔板底部，确保所有人源IPC细胞完全脱落。然后将细胞悬液转移至已标记的15毫升锥形管中。接着加入9毫升小鼠胚胎成纤维细胞培养基。为了灭活胰蛋白酶，将细胞以800 RPM离心3分钟。小心吸除上清液，保留完整的细胞沉淀。将细胞重悬于100 µL预热的人类干细胞核效应溶液中。使用1 mm的移液器吸头将细胞转移至核效应管中。向管内的细胞悬液中加入4 µg质粒DNA，通过轻轻旋转混匀细胞与DNA。将管在生物安全柜表面轻敲两次。将vete插入核效应装置的核效应器支架中。按下按钮x以选择程序B 0 1 6核效应细胞，此时将显示Okay。核转染过程完成时（通常需要一到五秒）。使用核转染试剂盒中提供的塑料移液吸头从vete中回收经核转染的细胞，通过Resus重悬于预热的CM和rock抑制剂中，置于无菌的1.5毫升eend或ph离心管中，在37°C下孵育10分钟。10分钟后，使用1毫升移液器吸头将细胞逐滴转移至饲养层上。次日，在37摄氏度下过夜培养细胞。监测转染效率。图中显示的是转染后12小时，在Gel Rex上使用Gene Juice转染携带强启动子的质粒，使EGFP表达的RIV一期人源诱导多能干细胞（iPSC）的显微照片。人源iPSC的DNA转染结果显示，使用Gene Juice进行瞬时转染时，通常有超过60%的细胞表达EGFP报告基因。通过核转染也可获得表达EGFP的细胞，如以下图片所示：RIV一人源IPC细胞在饲养层上接种并经核转染后形成克隆，核转染分别采用B 0 1 6核转染程序或A 0 2 3核转染程序。使用B 0 1 6程序可获得高达80%的EGFP阳性细胞，而A 0 2 3程序产生的EGFP阳性细胞则少于10%。此外，可由此获得稳定表达转基因的人源iPSC克隆。此处展示的是稳定表达EGFP的人类iPSC集落示例，其普遍的EGFP表达源自Gene Juice。这些细胞在拟胚体分化过程中仍保持持续的EGFP表达。观看本视频后，您应能充分理解如何对人类iPS细胞进行核转染和转染操作。高效的基因操作是研究干细胞生物学各个方面的关键工具，并将加速人类诱导多能干细胞系在再生医学中的应用。

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科研

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生物学

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利用携带GFP的逆转录病毒载体将人类体细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）

本文介绍了我们已建立的利用仙台病毒将人类体细胞重编程为无外源基因的人类诱导多能干细胞的方法，该方法具有稳定的结果和更高的效率。...

利用仙台病毒高效制备人诱导性多能干细胞

关键词：人诱导性多能干细胞，体细胞，仙台病毒，重编程，干细胞培养

我们描述了一种基于慢病毒的重编程方法，用于获得无外源因子的人类诱导性多能干细胞，并在疑似临床级条件下进行表征和转化。...

无外源基因人诱导性多能干细胞系的建立与表征及其向明确临床级条件的转化

本方案描述了通过强制表达转录因子，从人多能干细胞高效诱导生血内皮细胞和多能造血祖细胞的方法。...

通过转录因子过表达在人多能干细胞中直接诱导生血内皮和血液细胞

本论文提供了从拔取的毛发中分离和培养人角质形成细胞，并通过附加体型载体进一步生成无整合的人诱导性多能干细胞（hiPSCs）的逐步操作流程。...

利用毛发来源的角质形成细胞生成无整合的人诱导性多能干细胞

本文介绍了一种利用基于piggyBac的供体质粒和Cas9切口酶突变体，在人类多能干细胞中实现无缝基因编辑的详细方法。在人类胚胎干细胞（hESCs）中，将两个点突变引入肝细胞核因子4α（HNF4α）基因座的第8号外显子。...

利用无缝基因组编辑技术在人类多能干细胞中引入点突变

学习人类诱导多能干细胞的转染和核转染优化方案，建立无饲养层培养体系，实现高效率基因操作并最小化细胞死亡，为再生医学研究提供可靠的转基因iPSC细胞系构建方法。

转染和核转染人诱导性多能干细胞

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