转染和核转染人诱导性多能干细胞

本实验的总体目标是通过优化转染和核转染方案，在人诱导性多能干细胞中实现高效的转染效率。首先建立无饲养层培养的人诱导性多能干细胞体系，用于转染时，将人诱导性多能干细胞接种于明胶、TRX 或 matrigel 上过夜。

对于核转染，通过胰蛋白酶获得小的细胞团块，将质粒DNA与基因转染试剂的混合物加入已铺板的细胞中，随后将培养板离心并在37摄氏度下孵育。人iPS细胞悬液在核转染装置中进行核转染处理，然后将细胞重悬于MEF条件培养基中，并在37摄氏度下孵育。最终可获得结果，显示在人iPS细胞中通过高转染效率实现了高效的基因操作。

与先前描述的转染电穿孔和核转染等现有方法相比，该技术的主要优势在于，我们在实验室中能够常规实现人源iPS细胞的高效转染，并获得稳定一致的结果。我们的方案还能确保基因修饰后细胞死亡率最低。因此，该方案可实现转基因人源iPS细胞系的快速、大规模制备。在将人源诱导性多能干细胞适应无饲养层培养之前，需准备经gelt TRX包被的培养皿。

接下来，将先前在饲养层细胞上培养的人类胰岛前体细胞（IPCs）用每孔1 mL的视黄酸（Accutane）进行处理，在37°C下孵育1分钟，直至大多数细胞开始脱落；向细胞中加入10至15颗玻璃珠，轻轻晃动培养板。然后加入2 mL knockout D-M-E-M-F12培养基，轻柔吹打混匀。将细胞悬液转移至10 mL离心管中。

在室温下以800 RPM离心细胞3分钟。吸除上清液，保留人iPSC沉淀完整。轻轻弹击离心管以轻柔分散细胞沉淀。

Reese，将人iPSC细胞沉淀重悬于适量的STEM pro培养基中，并分配至经gel TRE包被的培养板各孔中。根据增殖速率，人iPSC细胞可按1:2至1:6的传代比例进行传代。将培养板小心放入含5%二氧化碳、37°C的培养箱中，并轻轻旋转培养板，以确保细胞在各孔中均匀分布。

每天更换培养基。当细胞融合度达到80%时，可再次传代至新的凝胶包被孔中。转染当天，按1:2的比例传代后，细胞融合度应约为40%至50%，并以较小的克隆形式均匀分布在凝胶包被的孔中，以获得最佳转染效率。

开始此操作前，在无菌的1.5毫升离心管中准备100微升敲除培养基。加入27微升Gene Juice转染试剂，充分混匀，并在室温下孵育5分钟。接着，加入4微克质粒DNA。

质粒的选择对于实现最佳转染效率至关重要。本实验所用质粒携带由CAG启动子驱动的增强型绿色荧光蛋白基因，该启动子是一种在人胰岛样细胞（IPCs）中具有强转录活性的启动子。将离心管于室温孵育15分钟。

15 分钟后，将基因转染液和 DNA 混合物加入细胞中，并混匀培养板。以 1,200 RPM 转速离心 5 分钟，以增加转染混合物与孔中人源 IPC 细胞的接触。于次日将细胞在 37 摄氏度条件下孵育过夜。

在转染当天监测转染效率，在人源诱导多能细胞（IPCs）进行核转染预处理前，用10 µM的ROCK抑制剂在37°C条件下预处理至少一小时。在无菌的1.5 mL离心管中准备82 µL人源干细胞核转染试剂溶液。加入80 µL。

加入补充物一，并用移液器充分混匀。将溶液在37摄氏度下孵育5分钟。孵育前，将预先准备的饲养细胞条件培养基和含EDTA的0.25%胰蛋白酶预热至37摄氏度，在生物安全柜中进行。

预先标记一个无菌的15毫升锥形管。小心移除拟进行核转移的人类iPSC培养物中的培养基，并用磷酸盐缓冲液轻轻洗涤细胞。吸除PBS，加入胰蛋白酶，在37摄氏度下孵育细胞3分钟。

为了成功进行核转染，关键在于不要将细胞消化成单细胞。相反，应将细胞吹打成由两到三个细胞组成的小细胞团。使用 P 1000 移液枪头轻轻吹打细胞，使其形成由两到三个细胞组成的小细胞团。

通过反复吹打洗涤孔板底部，确保所有人源IPC细胞完全脱落。然后将细胞悬液转移至已标记的15毫升锥形管中。接着加入9毫升小鼠胚胎成纤维细胞培养基。

为了灭活胰蛋白酶，将细胞以800 RPM离心3分钟。小心吸除上清液，保留完整的细胞沉淀。将细胞重悬于100 µL预热的人类干细胞核效应溶液中。

使用1 mm的移液器吸头将细胞转移至核效应管中。向管内的细胞悬液中加入4 µg质粒DNA，通过轻轻旋转混匀细胞与DNA。将管在生物安全柜表面轻敲两次。

将vete插入核效应装置的核效应器支架中。按下按钮x以选择程序B 0 1 6核效应细胞，此时将显示Okay。核转染过程完成时（通常需要一到五秒）。使用核转染试剂盒中提供的塑料移液吸头从vete中回收经核转染的细胞，通过Resus重悬于预热的CM和rock抑制剂中，置于无菌的1.5毫升eend或ph离心管中，在37°C下孵育10分钟。

10分钟后，使用1毫升移液器吸头将细胞逐滴转移至饲养层上。次日，在37摄氏度下过夜培养细胞。监测转染效率。

图中显示的是转染后12小时，在Gel Rex上使用Gene Juice转染携带强启动子的质粒，使EGFP表达的RIV一期人源诱导多能干细胞（iPSC）的显微照片。人源iPSC的DNA转染结果显示，使用Gene Juice进行瞬时转染时，通常有超过60%的细胞表达EGFP报告基因。

通过核转染也可获得表达EGFP的细胞，如以下图片所示：RIV一人源IPC细胞在饲养层上接种并经核转染后形成克隆，核转染分别采用B 0 1 6核转染程序或A 0 2 3核转染程序。使用B 0 1 6程序可获得高达80%的EGFP阳性细胞，而A 0 2 3程序产生的EGFP阳性细胞则少于10%。此外，可由此获得稳定表达转基因的人源iPSC克隆。

此处展示的是稳定表达EGFP的人类iPSC集落示例，其普遍的EGFP表达源自Gene Juice。这些细胞在拟胚体分化过程中仍保持持续的EGFP表达。观看本视频后，您应能充分理解如何对人类iPS细胞进行核转染和转染操作。

高效的基因操作是研究干细胞生物学各个方面的关键工具，并将加速人类诱导多能干细胞系在再生医学中的应用。