从小鼠黏膜下层和固有层分离肠胶质细胞

取一段先前已剥离纵行肌和肠肌丛的小鼠小肠，这些层含有肠神经元和胶质细胞。

将组织剪碎并放入含有EDTA的缓冲液中。在摇床上孵育。

EDTA 破坏细胞间连接，使上皮黏膜层与下方含有肠胶质细胞的固有层及黏膜下层结缔组织分离。

用移液器反复吹打以分离上皮细胞。

通过细胞滤网过滤，并弃去滤过液。

将组织转移至非酶解离缓冲液中，并在摇动条件下孵育。该解离缓冲液可松解固有层和黏膜下层的细胞外基质，从而使细胞脱离。

反复吹打以进一步解离细胞。

通过细胞滤网过滤以收集细胞。

离心并用缓冲液重悬细胞。

取含有胶质细胞生长培养基的黏附蛋白包被孔板，并接种细胞。

该涂层促进细胞黏附，而生长因子则选择性促进胶质细胞增殖，从而建立黏膜下层和黏膜固有层胶质细胞培养体系。

为了去除上皮黏膜，首先使用精细剪刀将肠道剪成约0.5厘米长的片段，并将这些片段收集到30毫升冰冷的EDTA/HEPES/DPBS溶液中。在4摄氏度下，以每分钟约60次的振荡频率摇动含有组织的溶液，持续10分钟。

用移液器吸取 EDTA/HEPES/DPBS 缓冲液上下吹打一次，以润湿一支 5 毫升塑料移液器，然后使用该已润湿的移液器将组织和缓冲液悬液吹打 20 次，以分离上皮黏膜。

将混合物倒入一个100微米的尼龙细胞滤网中以收集组织，使用尖头镊子将滤网上截留的组织转移至一个新的含有30毫升冰冻EDTA/HEPES/DPBS的50毫升锥形离心管中。再次进行EDTA/HEPES/DPBS孵育，将组织在4摄氏度下以每分钟约60次的频率摇动10分钟，以去除更多的上皮黏膜。

使用预先润湿的5毫升移液管进行轻柔吹打。随着越来越多的上皮组织被去除，组织倾向于粘附在移液管内壁。

此时需要轻柔吹打，因为肠胶质细胞更为脆弱。

将混合物倒入100微米尼龙细胞滤网中，收集第二次孵育后的组织，弃去滤过液。第二次滤过液应明显比第一次澄清。重复10分钟EDTA孵育步骤，直至溶液几乎透明。

将组织从尼龙滤网转移至含有5毫升商品化细胞回收溶液的15毫升圆锥形离心管中。然后在4摄氏度下摇动25至30分钟。轻柔吹打10次，使肠胶质细胞从黏膜固有层中解离，随后通过40微米滤膜过滤，并将滤液收集至干净的50毫升离心管中。

用 1 毫升 DPBS 冲洗尼龙滤膜上的组织。弃去组织，将 5 至 6 毫升滤液转移至洁净的 15 毫升锥形离心管中。在 4 摄氏度下，以 2,000 × g 的离心力在摆动吊桶式离心机中离心 5 分钟。

用500微升移液枪头轻轻吹打含有胶质细胞的沉淀，加入至少1毫升重悬缓冲液，上下吹打时避免产生气泡。最后，将肠胶质细胞接种至培养板中：若使用经层粘连蛋白包被的6孔板，则每孔加入200微升细胞悬液；若使用12孔板，则每孔加入100微升细胞悬液，培养基为含胶质细胞生长因子的培养液。