从猪脑中纯化毛细血管

0 次观看3:45 分钟 • July 8th, 2025

取一个猪脑。

去除覆盖在大脑表面的保护性膜——脑膜,以防止脑膜细胞污染。

刮取富含毛细血管的灰质区域,并将组织收集到含有培养基的培养皿中。

使用无针头的注射器研磨灰质以破碎组织。

将组织碎片转移至匀浆器中,进行匀浆以进一步破坏组织,释放脑毛细血管。

将匀浆液通过具有特定孔径的滤膜过滤,以截留毛细血管,使其他脑细胞流过。

将滤膜置于含有酶和DNase的溶液中。

酶可使贴壁细胞脱离,而DNase可降解污染的DNA,从而促进纯毛细血管的分离。

用滤器冲洗毛细管。

加入含有血清蛋白的培养基以灭活酶。 

将毛细血管转移至离心管中,离心并去除上清液。用新鲜培养基重悬纯化的毛细血管,用于后续分析。

开始此操作时,将脑组织置于无菌操作台中,用盛放在冰上、含1升PBS的烧杯轻轻冲洗脑组织。接着,使用精细尖头镊子小心去除每个脑组织的脑膜。使用解剖刀逐个刮取脑组织的灰质,并将分离出的组织转移至含有20毫升置于冰上的DMEM/F12培养基的培养皿中。

进行初步破碎时,将灰质材料通过一个50毫升的无针注射器。对所有脑组织重复此操作,并将收集的灰质材料合并在一起。用DMEM/F12培养基将分离的灰质材料转移至手持式组织匀浆器的研磨管中。先用松配合的研杵上下研磨8次,再用紧配合的研杵上下研磨8次,以匀浆样品。

接下来,使用带有滤器支架和140微米滤网的500毫升蓝色瓶盖瓶过滤匀浆,以分离毛细血管。将含有毛细血管的滤器放入含有消化液的培养皿中。随后,将培养皿置于37摄氏度、180转/分钟的摇床上孵育1小时,或每10分钟轻轻搅拌一次。

一小时后,用培养皿中的悬液将毛细血管从滤膜上冲洗下来。然后,将三个培养皿中的悬液分装至两个50毫升离心管中,并向每管加入10毫升DMEM/F12以终止消化反应。

将细胞悬液在 250 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟。随后,吸去上清液,并将每个沉淀重悬于 10 毫升 DMEM/F12 中。然后,向每根试管中再加入 20 毫升 DMEM/F12。

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最后更新:29 八月 2026