利用基因编辑的人诱导多能干细胞体外诱导神经肌肉接头

在含有 Rho 激酶抑制剂的干细胞培养基中，使用携带成肌细胞分化或编码 MYOD 蛋白的多西环素诱导型基因的基因工程人诱导性多能干细胞（iPSCs）开始实验。

将细胞转移至经ECM包被的培养板中，并进行孵育以促进细胞贴壁。

与此同时，该抑制剂可使细胞内Rho激酶失活，从而增强细胞活力。

用含有强力霉素的干细胞培养基替换原有培养基。

多西环素进入细胞并与激活蛋白结合。这些复合物结合到启动子上，诱导部分细胞的基因表达，产生MYOD蛋白，从而触发干细胞向肌细胞分化。

使用含有成肌分化因子的成肌分化培养基处理细胞，以促进多核肌管细胞的形成。

随后，加入含有神经生长因子的神经诱导培养基。

这些因子将剩余的诱导多能干细胞分化为运动神经元和施万细胞，后者在神经元周围形成髓鞘。

最后，更换为神经肌肉接头培养基，以促进运动神经元与肌管之间的连接，形成神经肌肉接头。

在添加1毫升细胞解离液至培养皿前，先用3毫升PBS洗涤细胞。37摄氏度孵育10分钟后，向每个孔中加入3毫升灵长类胚胎干细胞培养基，并轻轻吹打三次，使细胞从盖玻片上解离。

接下来，将含有脱离的干细胞的上清液汇集到一个50毫升的锥形管中进行离心，并将干细胞沉淀重悬于3毫升新鲜的灵长类胚胎干细胞培养基中，该培养基中添加了10 µM Y27632 ROCK抑制剂，用于细胞计数。

然后，将细胞稀释至每毫升培养基含 2 × 10⁵ 个细胞，并加入 ROCK 抑制剂至相应浓度，将 2 毫升细胞悬液分别加入包被有细胞外基质的 6 孔板每个孔中的盖玻片上。

24小时后，将每孔中的上清液更换为2毫升新鲜的灵长类胚胎干细胞培养基，培养基中添加1微克/毫升的多西环素，并将培养板放回细胞培养箱中继续培养24小时。

孵育结束后，将上清液更换为每孔2毫升含多西环素的分化培养基，将培养板放回细胞培养箱中继续培养10天。

孵育结束后，将上清液更换为每孔2毫升含多西环素的成肌分化培养基，将培养板放回细胞培养箱中继续培养10天。孵育结束后，将上清液更换为每孔2毫升神经肌肉接头培养基，将培养板放回细胞培养箱中继续培养30天。