一种用于神经元培养的背根神经节收获与解离技术

取一段大鼠的脊柱，并进行分割以取出脊髓。

分离背根神经节（DRG），即由卫星胶质细胞（SGC）包绕的一簇神经元。

将背根神经节（DRGs）置于生长培养基中。去除神经根以减少卫星胶质细胞（SGC）污染。

用胶原酶处理以降解组织基质，并进行洗涤以去除酶。

加入胰蛋白酶以破坏细胞间连接。添加含有可使胰蛋白酶失活的蛋白质的血清。

加入培养基并机械解离组织。过滤悬液以分离单个细胞，并通过离心去除组织碎片。

将细胞重悬以在密度梯度介质上铺层，并进行离心。

密度较高的神经元沉降到下层，有助于螺旋神经节细胞（SGCs）的分离。

用培养基重悬神经元，转移至包被有培养基质的孔板中，以促进细胞贴壁。

添加神经生长因子以促进神经元存活。

获取背根神经节（DRG）神经元时，在收获脊髓后，首先去除任何背侧部分，然后使用无菌且锋利的手术剪沿纵轴将脊柱切成两半，以暴露脊髓组织。在肋骨下方水平将脊柱切成两个较小的节段，然后用精细镊子轻轻取出全部脊髓组织，注意不要牵拉并移除DRG根部，这些根部表现为从椎管直接伸出的白色细丝状结构。

待所有脊髓核心组织完全移除后，使用极细的镊子牵拉整个背根神经节（DRG）根部，深入椎管内部，注意避免损伤神经节的根部。将DRG置于一个60平方毫米的培养皿中，内含3至4毫升添加了抗生素的Ham's F-12培养基。随后，在解剖显微镜下，使用无菌镊子和手术刀清除神经节周围多余的神经根，以减少卫星细胞的污染。

接下来，将背根神经节转移至含有1.8毫升新鲜F-12培养基的35毫米培养皿中，并加入200微升IV型胶原酶储备液。将背根神经节孵育1小时，然后用玻璃移液管小心吸除培养基，注意避免吸出或损伤背根神经节。

重复胶原酶处理步骤，并用F-12培养基洗涤背根神经节（DRG）。第二次洗涤后，向细胞中加入1.8毫升F12培养基和200微升胰蛋白酶，随后去除胰蛋白酶，并加入1毫升含有500微升胎牛血清（FBS）的培养基以终止酶反应。然后吸除培养基，并用F-12培养基轻柔洗涤DRG三次，以彻底清除血清残留。

现在，加入 2 毫升新鲜的 F-12 培养基喂养细胞，并使用玻璃移液管将细胞悬液小心转移至 15 毫升离心管中。上下吹打 8 到 10 次，轻柔地解离神经元，然后让细胞沉淀聚集在管底。待沉淀完全沉降后，将上清液转移至新管中，并向沉淀中加入 2 毫升新鲜 F12 培养基，重复机械解离和培养基转移操作，直至悬液变得均匀。

然后，将细胞悬液吹打3至4次，随后通过100微米细胞滤网将所得的匀浆悬液过滤至一个新的50毫升离心管中。将细胞转入15毫升离心管中离心。在离心过程中，取新配制的15%牛血清白蛋白，将15毫升离心管倾斜45度角，缓慢沿管壁滴加，利用管壁上的刻度数字作为参考，形成逐渐递增的蛋白梯度。

然后，吸去细胞中的上清液，保留最后500微升用于重悬沉淀，缓慢将细胞沿蛋白轨迹加入新