一种用于神经元培养的背根神经节收获和解离的技术

取大鼠脊柱的一部分并将其分开以切除脊髓。

分离背根神经节或 DRG，这是一组被卫星神经胶质细胞或 SGC 包围的神经元。

将 DRG 放入生长培养基中。去除神经根以减少SGC污染。

用胶原酶处理以降解组织基质并洗涤以去除酶。

引入胰蛋白酶以破坏细胞间连接。添加含有使胰蛋白酶失活的蛋白质的血清。

加入生长培养基并机械解离组织。过滤悬浮液以分离单个细胞，并离心以去除组织碎片。

重悬细胞以将它们分层在密度梯度培养基上，然后离心。

密度较高的神经元沉降在底部，有利于 SGC 的分离。

将神经元重悬于培养基中。将它们转移到培养底物包被孔上，允许细胞附着。

神经生长因子以促进神经元存活。

为了在采集脊髓后获得 DRG 神经元，首先去除任何背部，然后使用无菌和锋利的手术剪刀沿纵轴将脊柱分成两半，露出脊髓组织。将脊柱切成胸腔以下的两小段，然后用细镊子轻轻去除所有脐带组织，注意不要拉扯和去除DRG根部，DRG根部表现为直接从根管中出来的白色细丝。

所有核心组织后，使用非常细的镊子拉动整个 DRG 根部，深入椎管，注意不要损坏神经节根部。将DRG放入含有3至4毫升Ham's F-12培养基的60平方毫米培养皿中，并辅以抗生素。然后，在解剖显微镜下，使用无菌镊子和手术刀清除神经节周围多余的神经根，以减少卫星细胞的污染。

接下来，将DRG转移到含有1.8毫升新鲜F-12培养基的35平方毫米培养皿中，并加入200微升4型胶原酶储备溶液。将DRG孵育一小时，然后用玻璃移液器小心地吸出培养基，注意不要吸出或损坏DRG。

重复胶原酶步骤并用 F-12 培养基洗涤 DRG。第二次洗涤后，向细胞中加入1.8毫升F12培养基和200微升胰蛋白酶，除去胰蛋白酶并加入1毫升补充有500微升FBS的培养基以阻止酶促反应。然后，吸出培养基并用 F-12 培养基轻轻洗涤 DRG 三次，以去除血清的所有痕迹。

现在，用 2 毫升新鲜的 F-12 培养基喂养细胞，并使用玻璃移液器小心地将细胞悬液转移到 15 毫升管中。上下移液8至10次，轻轻解离神经元，然后让沉淀积聚在管底部。当沉淀沉淀后，将上清液转移到新管中，并在沉淀中加入2毫升新鲜的F12培养基，重复机械解离和培养基转移，直到悬浮液变得均匀。

然后，将细胞悬液研磨三到四次，然后通过100微米细胞过滤器将所得均质悬浮液过滤到新的50毫升管中。在 15 毫升管中离心细胞。当它们旋转时，将新鲜制备的 15% 牛血清白蛋白缓慢移液到以 45 度角保持的 15 毫升管内，以使用管上的数字作为形成轨迹的参考，形成渐进的蛋白质轨迹。

然后，从细胞中吸出上清液，保留最后500微升用于重悬沉淀，并沿着蛋白质轨迹将细胞缓慢分配到新管中。再次旋转细胞后，将沉淀重悬于 1 毫升改性 BS 培养基中，并将细胞接种在 24 孔板中的少量培养基中两小时。当细胞附着后，加入补充有每毫升神经生长因子50纳克的新鲜BS培养基。