分离与培养小鼠脑部周细胞

向小鼠脑组织中加入缓冲液并进行匀浆，以释放细胞和微血管。

接下来，将 BSA-葡聚糖溶液加入匀浆液中。混匀后离心以分离各组分。弃去上清液。

将微血管重悬于缓冲液中，并通过滤器过滤，以去除较大的血管。

现在，离心滤液并弃去上清液。将微血管重悬于含有DNase的缓冲液中。

加入蛋白水解酶以释放内皮细胞和周细胞。

DNase 降解 DNA。

加入含有 BSA 的缓冲液以终止酶活性。离心后弃去上清液。

将细胞重悬于培养基中，并接种至基底膜基质包被的多孔板上。孵育以促进细胞贴壁。

定期更换培养基。

内皮细胞形成单层结构，并支持周细胞的生长。

在明胶包被的多孔板中，使用周细胞培养基进行后续的细胞传代可促进周细胞生长，同时去除内皮细胞。

首先，将无特定病原体的4至6周龄雄性C57黑6小鼠的脑组织置于无菌、干燥、无绒毛的擦拭纸上，使用弯头镊子去除小脑、纹状体和枕神经。用棉签清除所有可见的脑膜，并将脑组织翻转至倒置位置。轻轻向外展开脑叶，清除所有可见的血管。随后，将去除了脑膜的脑组织放入一个含有15毫升冷洗涤缓冲液B的100毫米培养皿中。

为使组织均质化，将脑组织样本转移至Dounce组织研磨器的研钵管中，并向管中加入3至4毫升洗涤缓冲液B。使用松头研杵研磨组织55次。然后用洗涤缓冲液B冲洗研杵，再用紧头研杵将组织匀浆研磨25次。均质化结束后，将匀浆等分至两个50毫升离心管中，并加入1.5倍体积的预冷30%牛血清白蛋白葡聚糖溶液。随后剧烈振荡离心管，充分混匀匀浆。

为分离血管组分，通过离心沉淀细胞，并将上清液转移至两个新试管中。将沉淀物置于冰上预冷的洗涤缓冲液B中保存。在冰上用三毫升预冷的洗涤缓冲液B重悬沉淀物。

将收集的上清液离心，并重复此步骤一次。弃去上清液，将沉淀物重悬于 3 毫升洗涤缓冲液 B 中。然后，合并重悬的沉淀物，并用新鲜冷的洗涤缓冲液 B 将合并后的细胞悬液终体积调至 10 毫升。

随后，用10毫米移液管吹打细胞6次，直至肉眼不可见残留的细胞团块，然后使用真空滤器组件和尼龙筛网过滤细胞悬液。将筛网置于培养皿中，用新鲜的洗涤缓冲液B冲洗并刮取筛网，以回收所有毛细血管。接着，使用新的滤器进行第二次过滤。

将滤液等分至两个离心管中，通过离心收集细胞。弃去上清液后，将沉淀合并至一个含有预热的含酶洗涤缓冲液B的单管中，并向该管中加入预热的胶原酶-分散酶。将该管置于摇床水浴中，在37摄氏度下精确孵育33分钟，然后加入30毫升冷的洗涤缓冲液B以终止反应。

通过离心收集细胞，并小心弃去上清液。将沉淀物迅速但小心地在洗涤缓冲液B中重悬六次，每次均离心。弃去上清液后，将沉淀物重悬于数毫升完全DMEM培养基中，并将2毫升细胞悬液接种至三块Matrigel包被的六孔板的九个孔中，每孔加入含完全DMEM的细胞悬液。

将细胞培养物置于无菌的37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中培养24小时，然后小心去除每个孔中的碎片，并加入新鲜的DMEM培养基。48小时后，每48小时更换每个孔中的培养基。在第8至10天，当细胞达到100%汇合度时，将细胞传代至新的明胶包被的六孔板中的寄生虫培养基中，并将细胞放回细胞培养箱继续培养6至7天，期间进行监测。