分离和培养小鼠脑周细胞

0 views • 5:43 min • July 8th, 2025

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向小鼠脑组织中添加缓冲液并将其均质化以释放细胞和微血管。

接下来,将BSA-葡聚糖溶液加入匀浆中。混合并离心以分离组分。弃去上清液。

将微血管重悬于缓冲液中,并将它们通过过滤器,去除较大的血管。

现在,离心滤液并除去上清液。将微血管重悬于含有DNAs的缓冲液中。

添加蛋白水解酶以释放内皮细胞和周细胞。

DNase 降解 DNA。

添加含有BSA的缓冲液以停止酶活性。离心并丢弃上清液。

将细胞重悬于培养基中,并将它们接种在基质涂层的多孔板上。孵育,促进细胞粘附。

定期更换介质。

内皮细胞形成单层并支持周细胞生长。

随后在明胶包被的多孔板上的周细胞培养基中传代,促进周细胞生长,同时消除内皮细胞。

首先将来自特定无病原体的4至6周龄雄性C57黑色6小鼠的大脑放在无菌,干燥,无绒的湿巾上,并使用弯曲的尖端镊子去除小脑,纹状体和枕神经。用棉签去除所有可见的脑膜,然后将脑组织倒置。用轻微的向外抚摸打开肺叶,去除所有可见的血管。然后,将无脑膜脑组织放入含有15毫升冷洗缓冲液B的100毫米培养皿中。

要使组织均质化,请将脑样本转移到 Dounce 组织研磨机砂浆管中,并在管中加入 3 至 4 毫升洗涤缓冲液 B。使用松散的杵将组织切碎 55 次。然后,用洗涤缓冲液B冲洗杵,并用紧杵将组织浆料切碎25次。均质结束时,将浆液等分于两个50毫升管之间,并加入1.5倍体积的冷30%牛血清白蛋白葡聚糖。然后,用力摇动管子以混合浆料。

为了分离血管部分,通过离心沉淀细胞,并将上清液转移到两个新管中。将沉淀储存在冰上的洗涤缓冲液 B 中。将沉淀重悬于冰上的三毫升冷洗缓冲液 B 中。

心收获的上清液,并再次重复此步骤。弃去上清液,并将沉淀重悬于 3 毫升洗涤缓冲液 B 中。然后,将重悬的沉淀合并,并用新鲜的冷洗缓冲液 B 将混合的细胞悬液的最终体积达到 10 毫升。

此外,用 10 毫米移液器解离细胞六次,直到看不到残留的沉淀团块,并使用真空过滤器组件和尼龙网过滤器过滤细胞悬液。将过滤器放入培养皿中,并用新鲜的洗涤缓冲液B清除网状物并刮擦以回收任何毛细血管。然后,使用新的过滤器进行第二次过滤。

滤液平均分配在两个管之间,并通过离心收集细胞。弃去上清液后,将沉淀汇集到含有预热的洗涤缓冲液 B 和酶的单个管中,并将预热的胶原酶分散酶加入管中。将试管放入 37 摄氏度的摇动台水浴中精确 33 分钟,然后用 30 毫升冷洗涤缓冲液 B 停止反应。

通过离心收集细胞,并小心地丢弃上清液。快速但小心地将沉淀重悬于洗涤缓冲液 B 中六次,然后再次离心悬浮液。弃去上清液后,将沉淀重悬于完全DMEM培养基的毫升中,并将2毫升细胞悬液接种在完全DMEM中,在三个基质胶包被的六孔板的九孔中。

细胞培养物置于无菌的 37 摄氏度、5% 二氧化碳培养箱中 24 小时,然后小心地从每个孔中取出碎片,并加入新鲜的 DMEM 培养基。48小时后,每48小时更换一次每个孔中的培养基。在第 8 至 10 天,当细胞达到 100% 汇合度时,将寄生虫培养基中的细胞传代到新的明胶包被的六孔板上,并将细胞返回细胞培养箱中再进行 6 至 7 天并进行监测。

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Last updated: 27 June 2026