从小鼠海马组织获取单细胞悬液

0 次观看3:42 分钟 • July 8th, 2025

取灌注成年小鼠海马组织碎片,放入含有木瓜蛋白酶(papain)和DNase的解离管中。

将试管置于机械解离仪上。

解离仪通过机械方式将组织解离,使包括神经元和胶质细胞在内的细胞分散开来。

木瓜蛋白酶可降解组织的细胞外基质,从而释放细胞。DNase 可降解污染的 DNA。

加入含有 BSA 的缓冲液,使酶失活。

将悬液通过滤网过滤,以去除较大的碎片。

离心滤液。弃去富含酶的上清液。

用缓冲液重悬细胞,并转移至新的离心管中。

加入密度梯度介质,混匀,并用缓冲液覆盖混合物。

离心过程中,细胞和碎片会根据其密度形成不同的分层。

移除最上层的缓冲层和中间的碎片层。

向含有细胞的底层加入缓冲液并混匀。离心后弃去含有密度梯度介质的上清液。

用缓冲液重悬海马细胞,以进行后续分析。

用镊子将海马组织块转移至C管中,并向管内加入30 µL酶混合液2。旋紧管盖直至听到咔嗒声后,将管放入解离仪中,运行相应的程序。在程序运行期间,用2 mL BSA缓冲液预润湿置于50 mL锥形管上的70 µm细胞筛网。

解离程序完成后,向解离的组织中加入 4 毫升 BSA 缓冲液,并通过置于 50 毫升锥形管上的细胞筛过滤混合液。接着,向 C 管中加入 10 毫升 DPBS。然后盖紧管盖,轻轻涡旋混匀,再通过置于 50 毫升锥形管上的细胞筛过滤。将过滤后的细胞悬液进行离心。弃去上清液,注意不要扰动沉淀,将沉淀保存备用。

为去除碎片,用1,550微升冷的DPBS重悬沉淀,并将悬液转移至已标记的15毫升锥形管中。然后加入450微升冷的碎片去除溶液,用移液器吹打混匀。将1毫升冷的DPBS轻轻叠加在细胞悬液上方,移液时保持枪头紧贴锥形管管壁。重复该步骤,直至总叠加体积达到2毫升。

接下来,以3,000 × g 离心10分钟,加速度和刹车均设为最大。吸除最上层液体。然后,来回移动移液枪头以吸除中间白色层。尽可能去除中间层,同时不扰动最底层。接着,加入2毫升冷的DPBS,上下吹打混匀。然后,以1,000 × g 离心10分钟,加速度和刹车均设为最大。离心后弃去上清液,并将沉淀重悬于1毫升BSA缓冲液中。

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最后更新:22 八月 2026