0 次观看 • 3:42 分钟 • July 8th, 2025
取灌注成年小鼠海马组织碎片,放入含有木瓜蛋白酶(papain)和DNase的解离管中。
将试管置于机械解离仪上。
解离仪通过机械方式将组织解离,使包括神经元和胶质细胞在内的细胞分散开来。
木瓜蛋白酶可降解组织的细胞外基质,从而释放细胞。DNase 可降解污染的 DNA。
加入含有 BSA 的缓冲液,使酶失活。
将悬液通过滤网过滤,以去除较大的碎片。
离心滤液。弃去富含酶的上清液。
用缓冲液重悬细胞,并转移至新的离心管中。
加入密度梯度介质,混匀,并用缓冲液覆盖混合物。
离心过程中,细胞和碎片会根据其密度形成不同的分层。
移除最上层的缓冲层和中间的碎片层。
向含有细胞的底层加入缓冲液并混匀。离心后弃去含有密度梯度介质的上清液。
用缓冲液重悬海马细胞,以进行后续分析。
用镊子将海马组织块转移至C管中,并向管内加入30 µL酶混合液2。旋紧管盖直至听到咔嗒声后,将管放入解离仪中,运行相应的程序。在程序运行期间,用2 mL BSA缓冲液预润湿置于50 mL锥形管上的70 µm细胞筛网。
解离程序完成后,向解离的组织中加入 4 毫升 BSA 缓冲液,并通过置于 50 毫升锥形管上的细胞筛过滤混合液。接着,向 C 管中加入 10 毫升 DPBS。然后盖紧管盖,轻轻涡旋混匀,再通过置于 50 毫升锥形管上的细胞筛过滤。将过滤后的细胞悬液进行离心。弃去上清液,注意不要扰动沉淀,将沉淀保存备用。
为去除碎片,用1,550微升冷的DPBS重悬沉淀,并将悬液转移至已标记的15毫升锥形管中。然后加入450微升冷的碎片去除溶液,用移液器吹打混匀。将1毫升冷的DPBS轻轻叠加在细胞悬液上方,移液时保持枪头紧贴锥形管管壁。重复该步骤,直至总叠加体积达到2毫升。
接下来,以3,000 × g 离心10分钟,加速度和刹车均设为最大。吸除最上层液体。然后,来回移动移液枪头以吸除中间白色层。尽可能去除中间层,同时不扰动最底层。接着,加入2毫升冷的DPBS,上下吹打混匀。然后,以1,000 × g 离心10分钟,加速度和刹车均设为最大。离心后弃去上清液,并将沉淀重悬于1毫升BSA缓冲液中。
本文详细介绍了一种利用酶解消化和密度梯度离心法从小鼠成年脑组织中分离海马细胞的实验方案。该方法旨在获得具有活性的神经元和胶质细胞,用于后续分析。
从海马体等复杂组织中获得具有活性的单细胞悬液,对于靶点验证和表型筛选等下游应用至关重要。本方案可重复地分离出神经元和胶质细胞,有助于在神经科学药物发现中进行机制层面的风险评估。该方法为评估化合物对细胞功能及信号通路调控的影响提供了与疾病相关的实验体系。
该方法适用于从靶点假设验证到检测方法开发的整个发现过程,为功能验证提供了一步可靠的细胞制备流程。
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最后更新:22 八月 2026