0 次观看 • 3:21 分钟 • July 8th, 2025
使用转染试剂将经改造的慢病毒处理已贴壁的人多能干细胞。
该病毒携带由四环素响应及调控元件控制的抗生素抗性基因和神经源性转录因子基因。
带正电荷的转染试剂可增强病毒融合及其内容物的释放。
病毒RNA逆转录为DNA，并整合到干细胞DNA中，从而启动调控元件的表达，产生激活蛋白。
加入含有四环素衍生物的基础培养基，该衍生物可与激活蛋白形成复合物。
该复合物结合四环素反应元件，促进基因表达，产生诱导干细胞向神经元分化的神经发生相关转录因子。
加入含有抗生素药物的基础培养基，以清除未转染的细胞。
使用含有蛋白水解酶的消化液处理细胞，该酶可降解细胞外基质（ECM）并释放细胞。
去除酶液，将细胞重新接种至包被有细胞外基质的孔板中，并加入成熟培养基，以促进神经元成熟。
诱导分化前两天，加入1毫升细胞解离溶液，室温孵育10分钟以解离ES细胞。将细胞转移至离心管中。随后，用2毫升培养基洗涤孔板，并将洗涤液加入同一离心管中。在300 × g 条件下离心5分钟。然后，用培养基重悬细胞沉淀，并将细胞以每孔1 × 10⁵个细胞的接种密度接种至基质包被的六孔板中。
第二天，在新鲜的胚胎干细胞维持培养基中加入表达 Ngn2 和 PuroR 以及四环素转录激活因子的慢病毒，并加入 polybrene。第 0 天，在添加 N2 但不含形态发生素的 DMEM/F12 培养基中加入 2 微克/毫升的多西环素。第 1 天，在新鲜的 DMEM/F12 加 N2 和多西环素培养基中加入嘌呤霉素，使其终浓度为 1 微克/毫升。
用嘌呤霉素筛选转导细胞至少 24 小时。第 2 天，使用细胞解离液将正在分化的神经元解离，并将其重新接种至经基质溶液包被的 24 孔板中。在不含多西环素的 NBA/B27 培养基中培养细胞。将纯化的诱导神经元培养在包被有基于细胞外基质溶液的培养板上。