将小鼠胚胎干细胞分化为神经元网络群体

将小鼠胚胎干细胞接种于含有分化培养基的低吸附培养皿中。

在旋转条件下孵育，以促进细胞聚集并分化为神经元系。

将聚集体转移至离心管中，静置使其自然沉降。弃去上清液。

重悬聚集体并转移至含有添加了视黄酸的分化培养基的原始培养皿中。

视黄酸可诱导神经元基因表达，触发向神经前体细胞的分化。

将细胞团转移至离心管中。去除培养基，加入胰蛋白酶以解离细胞团。

加入抑制剂以中和胰蛋白酶。

用移液器反复吹打以获得均匀的细胞悬液。过滤悬液以去除聚集体。

离心并去除上清液。用培养基重悬细胞。

将细胞接种于聚合物包被的培养皿中，以促进细胞黏附。

移除培养基。加入含有生长因子的新鲜培养基，以促进神经元成熟并形成具有网络连接的神经元群体。

将胚胎干细胞（ESCs）分化为神经元的过程始于常规的细胞传代。以与之前相同的方法消化ESCs，但额外准备一个用于神经元分化的培养皿。将350 µL细胞悬液转移至含有25 mL分化培养基的10 cm低吸附培养皿中。

将培养皿置于组织培养孵育箱内，设置摇床转速为30至45转/分钟，温度为37摄氏度，二氧化碳浓度为5%，孵育48小时。48小时后，使用25毫升移液管将正在分化的细胞聚集体转移至50毫升锥形管中。

随后立即向培养皿中加入 25 毫升新鲜分化培养基。静置聚集体 2 至 5 分钟，使其沉降形成肉眼可见的沉淀，沉淀深度为 1 至 2 毫米。小心吸除上清液，忽略仍处于悬浮状态的单个细胞或小型聚集体，使用 P1000 移液器将细胞沉淀转移回培养皿中。将培养皿放回培养箱内的旋转摇床上。再经过 48 小时后，重复换液操作。此次加入 30 毫升分化培养基，并添加 6 微摩尔的全反式维甲酸。

此时形成的细胞沉淀物厚度将为二至四毫米。按照之前的方法孵育细胞后，最后一次重复更换培养基的操作，并在培养基中添加视黄酸。此时，细胞沉淀物的厚度将达到四至八毫米。

次日，按照方案书面部分所述准备包被表面。在铺板当天下午，将预先分装的 NPC 胰蛋白酶消化液和 0.1% 大豆胰蛋白酶抑制剂各 5 毫升在 37 摄氏度解冻。随后，使用 25 毫升移液管将分化聚集体从培养板转移至 50 毫升锥形管中。

让聚集体静置3至5分钟，然后小心吸除上清液，注意不要扰动沉淀。接着用5至10毫升PBS洗涤沉淀，待聚集体沉降后，吸除PBS并重复洗涤一次。第二次PBS洗涤后，向沉淀中加入5毫升NPC消化用胰蛋白酶溶液，在37摄氏度孵育5分钟，孵育期间轻弹管壁2至3次。

接下来，向细胞中加入5毫升0.1%的大豆胰蛋白酶抑制剂，并通过倒置轻轻混匀。然后，用10毫升移液管轻柔吹打细胞10至15次，直至形成相对均一的细胞悬液。将细胞悬液缓慢通过置于50毫升锥形管上方的40或70微米细胞筛进行过滤。

然后，待所有悬液过滤完毕后，向滤器中加入1毫升N2培养基，以冲洗残留的细胞通过滤网。将细胞悬液转移至15毫升锥形管中，并在200 × g 条件下离心6分钟。

吸出培养基后，勿扰动沉淀，用 2 毫升 N2 培养基重悬并吹打混匀，然后加入 N2 培养基至总体积为 10 毫升。在 200 × g 条件下离心 5 分钟。吸去上清液，并重复洗涤沉淀一次，再次用 10 毫升 N2 培养基重悬沉淀。

取出部分细胞，用血细胞计数板计数，然后重复离心步骤。将细胞重悬于N2培养基中，调整终浓度为每毫升1×10⁷个细胞，并以每平方厘米150,000至200,000个细胞的密度接种于DIV减1天时准备好的培养皿中，置于37摄氏度的组织培养孵箱中培养。按照书面实验方案中的说明维持ESN细胞的培养。