一种从海马齿状回非神经元细胞中分离细胞核的技术

在冰冷的匀浆缓冲液中取小鼠脑中的齿状回。

通过机械解离释放神经元、胶质细胞和干细胞。

缓冲液中的温和去污剂可使细胞通透，释放细胞核及其他细胞器。

过滤匀浆以去除组织碎片。然后离心，去除细胞器，并在匀浆缓冲液中重悬，以裂解任何完整的细胞。

再次离心，移除含有释放出的细胞器的上清液，并将细胞核重悬于洗涤缓冲液中。

过滤以去除任何碎片，离心，然后移除上清液。

引入一种荧光DNA染料以标记所有细胞核，以及一种与神经元核抗原（NeuN）结合的荧光标记抗体，用于标记神经元细胞核。

利用荧光激活的细胞核分选技术，识别具有较高DNA染色荧光强度和较强散射特性的聚集体，从而分离出单个细胞核。

对单个细胞核进行分析，分离出 NeuN 阳性的神经元细胞核，并获取属于胶质细胞和干细胞的 NeuN 阴性细胞核。

使用松散的A型研杵匀浆组织，上下研磨10次，随后使用紧密的B型研杵研磨15次。将匀浆液转移至预冷的15毫升离心管中。用1毫升冷HB缓冲液冲洗Dounce匀浆器，并将冲洗液合并至同一离心管中。

向15毫升离心管中加入3毫升HB缓冲液，冰上孵育5分钟。轻轻倒置离心管两次，混匀核悬液。取0.5毫升HB缓冲液，预润湿置于50毫升试管上方的70微米细胞筛网盖。随后，将核悬液过筛，并用0.5毫升HB缓冲液冲洗细胞筛网。

接下来，移除细胞滤筛，将离心管放入水平转子离心机中，在 4 摄氏度下以 500 g 离心 5 分钟。弃去上清液。使用 P1000 移液器将沉淀物轻轻重悬于 4 毫升 HB 中。

冰上孵育5分钟后，在4摄氏度下以500 g离心10分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于3毫升洗涤液中。取0.5毫升洗涤液预湿置于50毫升试管上的35微米滤网帽。然后，使用P1000移液器每次吸取0.5毫升悬液，将细胞核悬液逐次过柱过滤。

用 0.5 毫升洗涤液清洗滤器帽后，将离心管置于冰上。将滤液转移至新的 15 毫升离心管中，在 4 °C 条件下以 500 g 离心 5 分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于 3 毫升洗涤液中。

重复离心操作，并将沉淀重悬于1毫升洗涤培养基中，其中包含小鼠抗Neu抗体和AlexaFluor488标记的抗体，以及1微克/毫升的DAPI。将反应体系置于冰上避光孵育45分钟。

进行荧光激活细胞核分选（FANS）时，将免疫染色后的细胞核悬浮液转移至5毫升试管中，并置于冰上，直至开始流式细胞术操作。

将试管放入流式细胞仪之前，以低强度涡旋振荡样品三秒钟。

为了从染色的细胞核悬液中获取数据，需在DAPI高度（DAPI height）和DAPI面积（DAPI area）上设置门控，以排除细胞碎片和聚集的细胞核。然后，在对数侧向散射（log side-scatter 或 SSC area）和对数前向散射（log forward-scatter 或 FSC area）上设置门控，以将单个细胞核与其余DAPI染色的聚集体或细胞碎片分离开来。

然后，通过设定抗 NeuNAF488 和 FSC 面积的门控，分离 NeuNAF488 阴性细胞群。

分析后，使用设门策略，将抗NeuNAF488阴性群体分选至含有50 µL洗涤培养基的1.5 mL收集管中。