线虫生殖细胞命运重编程为神经元

在线虫生长培养基上培养基因工程菌。

这些细菌携带一种含有线虫染色质调控因子基因的质粒。

培养基中含有诱导剂，可触发细菌基因组中转基因RNA聚合酶的表达，该聚合酶将染色质调控因子基因转录为双链RNA（dsRNA）。

加入携带热激启动子驱动的神经元命运诱导型转录因子基因的转基因线虫幼虫。

细菌摄取后，摄入的dsRNA会产生siRNA，从而下调染色质调控因子的表达，促进细胞命运重编程。

通过亲代的生殖细胞，siRNA 被传递给子代。

生殖细胞后代中染色质调控因子表达的下调，表现为阴门突出表型，使其能够发生重编程。

对后代施加热激，激活热激启动子，表达诱导神经元命运的转录因子，从而触发神经元分化，将生殖细胞转化为神经元。

这些神经元表达一种转基因荧光报告蛋白，便于显微观察。

使用铂金丝将每份 50 只 L4 期线虫手动转移至 NGM RNAi 培养板。L4 期线虫可通过其腹侧约中间位置的白色斑块进行识别。随后，将线虫在黑暗条件下于 15 °C 培养约七天。IPTG 对光敏感。

当F1代发育至L3和L4阶段时，将其从体型更大、更粗壮的亲代个体中分离。此时，筛选F1代中具有突出阴门表型的个体，该表型表明针对lin-53的RNA干扰已成功实现。RNA干扰效应还可能导致个体致死，且在温度高于15摄氏度时致死率升高。为了激活G1并诱导F1代中生殖细胞向神经元的转化，需将线虫置于黑暗条件下，在37摄氏度进行30分钟的热激处理。建议使用带通风的培养箱，因其可实现更高效的热激效果。

热激后，将培养板置于 25 摄氏度避光条件下过夜培养。需要注意避免在动物发育至中期 L3 阶段之前通过热激诱导 Q1 的过表达，否则可能导致 Q1 蛋白在非靶向组织中表达。次日，使用荧光光源和 GFP 滤光片观察动物中段区域由转基因产生的荧光。