将人诱导性多能干细胞分化为类似小胶质细胞

从含有悬浮培养的人诱导性多能干细胞的低黏附多孔板开始，培养基为拟胚体（EB）培养基。

离心以沉淀细胞。孵育以促进细胞增殖和聚集，形成类胚体。

细胞谱系调控因子促进细胞向髓系祖细胞分化。

收集这些拟胚体并转移至包被有细胞外基质或ECM的培养板边缘。

更换为原始巨噬细胞前体（PMP）分化培养基，并轻轻振荡。孵育以促进胚胎体（EBs）附着于细胞外基质（ECM）。

更换一半培养基并继续培养。

造血生长因子驱动髓系前体细胞分化为原始巨噬细胞前体，这些细胞从拟胚体中分离并出现在培养基中。

收集这些 PMPs 并离心沉淀细胞。将细胞重悬于小胶质细胞分化培养基中。

将这些细胞接种于包被有层粘连蛋白的多孔板中，并进行培养。

PMP利用分化因子和营养物质，分化为类似小胶质细胞的脑免疫细胞。

接种细胞时，将100微升稀释后的细胞悬液加入低吸附圆底96孔板的每个孔中。以125 × g离心该板 g 3分钟，然后在37摄氏度和5%二氧化碳条件下培养4天。

第2天，使用多通道移液器，将旧的半量EB培养基更换为新鲜培养基。为了生成原始巨噬细胞前体（PMPs），在6孔板的各孔中加入1毫升冰冻的Matrigel包被溶液进行包被。随后，将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳环境中孵育2小时或过夜。

在EB分化第4天，使用1毫升移液器吸头将EB转移至包被有Matrigel的孔中。上下吹打以使EB从孔壁脱离。然后，将培养板倾斜放置，使EB沉降到孔的边缘。

待所有拟胚体沉降后，轻柔地用移液管吸除旧培养基，并沿孔壁加入3毫升新配制的PMP完全培养基，注意将拟胚体保留在孔边缘。通过手动左右及前后轻轻晃动培养板，使细胞在孔内均匀分布。随后将培养板置于培养箱中孵育七天，使拟胚体贴附于孔底。

七天后，在4倍放大倍数的明场显微镜下观察胚状体（EBs），确保其已贴附于孔板底部。进行半量换液，并在第21天将完全培养基更换为3毫升PMP完全培养基。

第28天，在上清液中观察呈圆形的细胞，即所谓的PMPs。随后，使用10毫升移液器和自动移液器收集含有PMPs的培养基，注意不要扰动拟胚体（EBs）。

将培养基中的PMP转移到15毫升锥形管中。在200 × g 条件下离心收集的PMP 4分钟，吸除上清液，然后用1至2毫升小胶质细胞样细胞或IMG基础培养基重悬。

然后，按照之前所述方法使用血细胞计数板对细胞进行计数。将剩余细胞离心，并将PMPs稀释至所需浓度。接着，用新配制的IMG完全培养基，将细胞以每平方厘米10⁵个细胞的密度接种于经细胞培养处理的培养板中。