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神经科学
0 次观看 • 5:09 分钟 • July 8th, 2025
取含有穆勒胶质细胞（MG细胞）和神经元的小鼠视网膜。
将它们置于含有消化酶的解离溶液中，并在温和摇动条件下孵育，以确保酶分布均匀。
这些酶可降解细胞外基质，使单个细胞脱离。
用移液器将视网膜上下吹打数次，以释放细胞。
加入抑制剂以终止酶活性，然后离心。
弃去上清液。
将细胞重悬于含有针对MG细胞的特定生长因子的培养基中。
将细胞转移至培养孔中并进行孵育。
随着时间的推移，培养基中的生长因子促进 MG 细胞的生长与增殖，而不再分裂的神经元细胞则逐渐死亡。
移除培养基，用盐缓冲液洗涤。
加入消化酶孵育，使细胞从孔板上脱落。
将细胞收集到离心管中，然后进行离心。
弃去含有死亡神经元细胞的上清液。
将 MG 细胞重悬于培养基中，用于进一步分析。
按照论文所述配制木瓜蛋白酶和DNase I消化液。现在，使用尖端扩大的移液管吸取视网膜组织。待视网膜沉降至吸头底部后，将视网膜释放至含有木瓜蛋白酶和DNase I混合液的离心管中，注意避免带入过多HBSS。
接下来，将离心管置于孵育器中的摇床上，于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育10分钟。随后，用1毫升移液器轻柔地上下吹打，使细胞解离。细胞解离后，加入275微升来自木瓜蛋白酶解离试剂盒的卵黏蛋白蛋白酶抑制剂以中和木瓜蛋白酶，并通过上下吹打轻轻混匀。
将离心管放入离心机，在4摄氏度下以300 × g的相对离心力离心8分钟。向预热至37摄氏度的计算体积的生长培养基中加入表皮生长因子。小心地从离心机中取出离心管。
小心且完全地移除上清液，注意不要触碰管底的沉淀物。接着，用500微升添加了表皮生长因子的培养基重悬细胞沉淀。然后，将细胞悬液转移至已标记的12孔板中的一个孔内。用另外500微升添加了表皮生长因子的培养基冲洗离心管，并将冲洗液加入同一孔中。
轻轻摇动培养板。然后将培养板放入37摄氏度含二氧化碳的培养箱中。首先检查细胞融合度是否达到90%至100%。接着吸去培养基，加入1毫升冰冷的HBSS洗涤培养孔。轻轻摇动培养板，彻底吸去HBSS，不得残留任何痕迹。
随后，加入 500 µL 预热的含胰蛋白酶溶液，使细胞从孔中脱落。轻轻摇动，并在 37 °C 培养箱中孵育 2 分钟。将培养板从培养箱转移至生物安全柜后，倾斜培养板并吸除含胰蛋白酶的溶液。小心且缓慢地将溶液在孔内反复吹打数次，直至细胞完全脱落。
接下来，将该细胞悬液转移至无菌的1.5毫升离心管中，将离心管放入离心机。以300 × g离心 g 在4摄氏度下离心8分钟，然后将离心管放回生物安全柜中。移除上清液，注意不要触碰沉淀。随后，加入600微升预热的培养基，轻轻吹打30至40次，使细胞沉淀充分重悬。