建立从小鼠视网膜获得的 Müller 神经胶质细胞培养物

取含有 Müller Glial 或 MG 细胞的小鼠视网膜和神经元。

放入含有消化酶的解离溶液中，轻轻摇晃孵育，以确保酶分布均匀。

这些酶分解细胞外基质，分离单个细胞。

上下移液视网膜数次以释放细胞。

添加抑制剂以停止酶活性，然后离心。

弃去上清液。

细胞重悬于含有MG细胞特异性生长因子的培养基中。

细胞转移到孔中并孵育。

，培养基中的生长因子促进了 MG 细胞的生长和繁殖，而非分裂的神经元细胞会死亡。

取出介质。用盐缓冲液洗涤。

与消化酶一起孵育，使细胞从孔中分离出来。

细胞收集在管中，然后离心。

丢弃含有死亡神经元细胞的上清液。

MG细胞重悬于培养基中以进行进一步分析。

手稿中所述制备木瓜蛋白酶 DNase I 解离混合物。现在，使用加大的尖端转移移液器，拾取视网膜。等到视网膜沉降在尖端底部，然后将视网膜释放到含有木瓜蛋白酶DNase I混合物的试管中，而没有过多的HBSS。

接下来，将试管放在培养箱中的章动器上，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 10 分钟。接下来，用 1 毫升移液器小心地上下移液来解离细胞。细胞解离后，从木瓜蛋白酶解离试剂盒中加入275微升卵粘蛋白酶抑制剂以中和木瓜蛋白酶，并通过上下移液轻轻混合。

试管放入离心机中，以 300 的相对离心力在 4 摄氏度下旋转 8 分钟。将表皮生长因子添加到预热在37摄氏度的生长培养基的计算体积中。小心地从离心机中取出试管。

在不接触管底部的沉淀的情况下，小心地完全去除上清液。现在，用 500 微升补充表皮生长因子的生长培养基重悬细胞沉淀。然后，将细胞悬液转移到标记的 12 孔板的一个孔中。用另外 500 微升补充表皮生长因子的生长培养基冲洗试管，并将其添加到孔中。

小心摇动孔板。然后，将板放入装有二氧化碳的 37 摄氏度的培养箱中。首先检查 90% 至 100% 的细胞汇合度。接下来，取出培养基，加入 1 毫升冷 HBSS 洗涤孔。轻轻摇动板并去除HBSS，不留任何痕迹。

之后，加入 500 微升预热的含胰蛋白酶溶液，将细胞从孔中分离出来。轻轻摇晃，在37摄氏度的培养箱中孵育2分钟。将板从培养箱移至生物安全柜后，倾斜吸出含胰蛋白酶的溶液。将其小心缓慢地分散在孔上数次，直到细胞完全分离。

接下来，将该细胞悬液转移到无菌的 1.5 毫升管中，并将管放入离心机中。在 4 摄氏度下以 300 g 旋转 8 分钟，然后将试管带回生物安全柜。在不接触沉淀的情况下除去上清液。现在，通过加入 600 微升预热的生长培养基并上下移液约 30 至 40 次，小心地重悬细胞沉淀。