0 次观看 • 5:00 分钟 • July 8th, 2025
取灌注的大鼠海马组织片段。
用木瓜蛋白酶孵育以消化组织的细胞外基质，并解离包括神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞在内的细胞。
加入DNase并混匀。
使用直径逐渐减小的移液管对组织进行机械解离，以获得单细胞悬液。孵育以使DNase降解污染的DNA。
将悬液通过滤网过滤，去除碎片。
加入含有二价离子的缓冲液以终止酶活性。
离心并弃去富含酶的上清液。
现在加入缓冲液和抗髓鞘磁珠，孵育以使磁珠结合髓鞘碎片。
孵育后，离心并弃去上清液。
将混合物用缓冲液重悬，并加载到磁性分离柱中，该柱内含有置于磁性分选仪磁场中的铁磁性微球。
磁场将与磁珠结合的髓鞘碎片保留在层析柱中，而无髓鞘的细胞则通过层析柱。
用缓冲液洗涤层析柱，并收集含有神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞的流穿液。
使用无菌剃刀片将从成年脑组织中收获的每个样本在六孔培养板的盖子上切成30至400毫克的小块，开始神经组织的解离。然后将组织浸入1毫升无钙、无镁的HBSS中，并用移液器将样本转移至无菌的2毫升离心管中。
当所有组织收集完毕后，离心样品，吸除上清液，将样品置于37摄氏度水浴中孵育15分钟，每隔5分钟轻轻颠倒试管数次，以重新悬浮沉降的组织碎片。
孵育结束后，向每个样本中加入30微升 freshly prepared enzyme mixed tube，并轻轻颠倒混匀。然后，使用标记为1的巴斯德移液管，对每个样本进行30次上下吹打以解离组织，注意避免产生气泡。将样本在37摄氏度继续孵育15分钟，每隔5分钟颠倒混匀一次，随后如前所述，使用编号为2的巴斯德移液管对样本进行解离。
然后，换用移液管3号。重复解离操作，并将样品在水浴中继续孵育10分钟，每5分钟颠倒混匀一次。孵育结束后，将单细胞悬液通过80微米细胞滤网过滤至15毫升Falcon管中，每个滤网用10毫升无钙、无镁的HBSS冲洗，以终止酶反应。当最后一个样品过滤完成后，离心收集细胞，吸除上清液。
为了去除细胞悬液中的髓鞘，将沉淀物在400 µL髓鞘去除缓冲液中充分重悬，并向每根试管中加入适量的髓鞘去除磁珠。反复吹打溶液，直至细胞与磁珠充分混匀。随后，将样品在4°C下孵育15分钟。孵育结束后，用5 mL髓鞘去除缓冲液洗涤每个样品。
细胞离心的同时，将每个样本的一根柱子置于磁力分选仪的磁场中，并在每根柱子上方放置一个洁净的80微米滤网。用1毫升髓鞘去除缓冲液冲洗每根滤网和柱子三次，每次冲洗液均收集至废液容器中。
最后一次洗涤后，将5毫升聚苯乙烯圆底试管直接置于每根柱子下方，以收集洗脱液。然后吸除样品中的上清液，并将沉淀物重悬于500微升髓鞘去除缓冲液中。
立即将细胞悬液加入柱中，用下方的收集管收集细胞。随后，每次用1毫升髓鞘去除缓冲液，每根滤柱清洗4次。最后一次清洗后，离心沉淀细胞，并吸除上清液。