0 次观看 • 5:29 分钟 • July 8th, 2025
收获小鼠脊髓并将其切成碎片。
将片段转移至含有蛋白酶和DNase的离心管中。涡旋混匀并孵育。
该酶消化组织的细胞外基质，而DNase则降解污染的游离DNA。
再次涡旋并反复移液，以完成组织解离，获得单细胞悬液。
离心并弃去上清液。将细胞重悬于含有DNase和蛋白酶抑制剂的溶液中，涡旋混匀。该抑制剂可中和酶的活性。
在上层加入新鲜的抑制剂溶液，离心后弃去上清液。
将细胞重悬于密度梯度培养基中，涡旋混匀，然后离心。
细胞沉降到底部，而髓鞘碎片则保留在顶部。
弃去碎片。用缓冲液反复洗涤，离心并移除上清液。将细胞重悬于培养基中。
接种细胞。未包被的表面有助于胶质细胞的贴附。
移除用过的培养基，并加入新鲜培养基以诱导胶质细胞增殖，建立混合胶质细胞培养体系。
在超净工作台内操作，将四只小鼠的脊髓转移至盛有HBSS的培养皿中。使用无菌剪刀和镊子将每条脊髓剪切成小块。随后，将组织块转移至含有木瓜蛋白酶和DNase酶混合液的50毫升锥形管中。注意避免将HBSS一同转移至酶混合液中，以免影响酶的活性。
为了获得单细胞悬液，必须充分消化组织块。然而，过度消化会导致活细胞数量减少。每个实验室都需要进行预实验，根据各自细胞的最佳消化效果来确定确切的消化时间。
接下来，轻轻涡旋混匀管内液体，然后在37摄氏度下孵育1小时，同时以每分钟150转的速度进行轨道振荡。孵育结束后，再次涡旋混匀管内液体，随后使用5毫升移液器用力吹打组织，以促进进一步解离。然后，将细胞悬液转移至15毫升离心管中，在室温下以300 × g 离心5分钟。
离心期间，在无菌管中将300微升重悬的白蛋白卵黏蛋白抑制剂溶液加入2.7毫升EBSS中，并充分混匀。然后加入150微升DNase溶液。离心结束后，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于 freshly prepared 白蛋白卵黏蛋白抑制剂和DNase溶液中。充分涡旋震荡以彻底分散细胞沉淀。
然后，向细胞悬液中加入3毫升未含DNase的重组白蛋白-卵黏蛋白抑制剂溶液。以70 × g离心细胞 g 室温下离心6分钟。离心后弃去含有膜碎片的上清液，保留沉淀。
为了去除解离的脊髓细胞中的髓鞘，首先将 8 毫升室温的 20% 密度梯度介质加入含有细胞沉淀的离心管中，轻轻涡旋混匀。接着，在室温下以 800 × g 离心 30 分钟，离心过程中不得中断。离心结束后，小心吸除上层碎片（主要含有髓鞘）以及上清液，保留沉淀。
为去除残留的密度梯度，用8毫升用HBSS稀释的cDMEM重悬细胞沉淀进行洗涤。在4摄氏度下以400 g离心10分钟。弃去上清液，并按前述方法用稀释的cDMEM再次洗涤细胞。
去除上清液后，将沉淀物置于冰上保存，直至接种细胞。准备铺板时，用14毫升添加了2-巯基乙醇的完全DMEM培养基重悬细胞，并将1毫升细胞悬液加入12孔板的每个孔中。
接种额外的孔，用于测定每孔的平均细胞数量以及培养物中的小胶质细胞含量。细胞接种后，在35.9摄氏度、5%二氧化碳条件下培养。在第1天（即接种后的第二天）更换培养基。
部分细胞已贴附于培养板上，但仍大多呈圆形。同时存在大量悬浮细胞和明显碎片。此后每三到四天重复更换培养基一次。