将永生化多能耳源性前体细胞分化为螺旋神经节神经元及分化效果评估

取一个含有无菌盖玻片的多孔板，盖玻片上已包被细胞培养基质。

将永生化的多能耳源性前体细胞（iMOPs）引入神经元分化培养基中。

iMOPs 是多种内耳细胞的前体细胞，包括将听觉信息传递给大脑的螺旋神经节神经元（SGNs）。

孵育，使细胞贴附于基质。培养基可诱导iMOPs分化为SGNs。

加入固定剂以诱导蛋白质交联，保持细胞形态，同时加入去垢剂溶液以通透细胞膜。

加入封闭试剂以防止非特异性标记。

加入针对神经元分化标志物的荧光素偶联抗体并孵育，使抗体标记螺旋神经节神经元（SGNs）。

洗涤以去除未结合的抗体，并用含有荧光核染料的封片剂封片。

利用荧光显微镜检测抗体信号，以确认iMOPs向SGNs的分化。

首先，将圆形玻璃盖玻片放入无菌的100毫米培养皿中，并用70%乙醇浸没，以进行清洁。轻轻振荡盖玻片，确保其完全被浸润，并在室温下静置10分钟。随后，用无菌1×PBS冲洗盖玻片三次，再用无菌水冲洗一次。

然后，将盖玻片置于生物安全柜中暴露于紫外光下15分钟，使其干燥。如需立即使用，将一片无菌盖玻片放入24孔板的每个孔中，并轻轻震荡孔板，确保所有盖玻片完全平铺。随后，向每孔加入0.25毫升含10微克/毫升多聚-D-赖氨酸的1×PBS，对盖玻片进行包被。

将培养板在 37 摄氏度下孵育 1 小时后，吸除聚-D-赖氨酸溶液，并用无菌的 1× PBS 洗涤各孔 3 次。最后一次洗涤液吸除后，向每个 24 孔中的孔加入含 10 微克/毫升层粘连蛋白的 0.25 毫升 1× PBS。将培养板在 37 摄氏度下过夜孵育后，吸除层粘连蛋白溶液。然后，用 1 毫升 1× PBS 洗涤每个孔 3 次，但在细胞准备接种前，保留最后一次洗涤的 PBS 于孔中。

开始神经元分化时，按照先前所述方法计数解离后的耳球细胞，然后将其重悬于预热的神经元分化培养基中。随后将 1 至 1.5 × 10⁵ 个细胞接种于培养容器中。⁵ 将iMOP细胞接种至含有包被盖玻片的培养板各孔中。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养，每隔一天更换一次神经元分化培养基。

培养七天后，吸去培养基，并通过向每个孔中加入4%多聚甲醛，在室温下固定15分钟，使细胞（应已贴附在盖玻片上）固定。随后，去除多聚甲醛溶液，用含0.1% Triton X-100的1×PBS洗涤细胞一次。接着，移去洗涤液，向每个孔中加入封闭液，封闭液为含10%正常山羊血清和0.1% Triton X-100的1×PBS。

将细胞在室温下放置一小时，然后吸去液体，并加入含有适当稀释比例的 Cdkn1b 或 Tubb3 抗体的封闭缓冲液。在 4 摄氏度下孵育过夜后，用含 1% Triton X-100 的 1× PBS 洗涤细胞一次，随后按照先前所述方法进行免疫染色。染色完成后，向孔中加入 1× PBS 进行最后一次洗涤。

为进行分析，将贴附有染色细胞的盖玻片从24孔板中取出，并将其放置在载玻片的封片剂上。在4摄氏度下静置过夜使封片剂干燥后，按照之前所述方法采集落射荧光图像。