转基因小鼠胚胎动眼神经核脑片的离体培养与成像

取一只转基因妊娠小鼠，手术分离含有胚胎的子宫，并清洗以去除残留血液。

取出含有荧光标记运动神经元的胚胎，并将其转移至多孔板的盖子中。

加入熔化的琼脂糖，冷却盖子以诱导凝胶形成，从而包埋胚胎。

在荧光显微镜下，将动眼神经核与眼睛对齐成一条直线，并沿该直线修切琼脂糖。

将胚胎固定在样品台上，并置于装有冷切片缓冲液的振动切片机样品室中。

使用振动切片机，制备包含动眼神经核和眼睛的脑片。这些神经核形成动眼神经，支配眼球运动。

将切片转移至含培养基的多孔板内的培养插件中，并进行孵育。

使用荧光显微镜定期成像，以观察荧光标记的动眼神经元延伸轴突并到达眼睛的过程。

开始操作前，首先通过超声在配种后第10.5天确认小鼠妊娠。收集胚胎，用70%乙醇喷洒怀孕小鼠的腹部，使用剪刀打开腹腔以取出子宫。将子宫置于含冰冻HBSS的培养皿中清洗，然后将其放入另一含新鲜冰冻HBSS的培养皿中。

在解剖显微镜下，从子宫角中取出胚胎及其各自的羊膜囊，将每只胚胎置于预冷的12孔板盖子的内侧表面，随取随放于冰上。用滤纸吸除胚胎周围液体，注意不要触碰胚胎本身，随后将胚胎浸入液体状的4%低熔点琼脂糖中。

将培养皿盖置于冰上以使琼脂糖凝固。当琼脂糖完全硬化后，翻转胚胎，并在每个样本的另一侧覆盖额外的琼脂糖。待第二层琼脂糖凝固后，使用荧光体视显微镜修整每个胚胎周围的琼脂糖，以便每个胚胎能够在振动切片机载物台上正确地定向。

动眼神经核及早期轴突生长应呈现荧光。调整每个胚胎的位置，使细胞核、发出的轴突和眼睛呈一条直线，并使用剃刀沿此直线平行方向修剪琼脂糖。接着，用冰冷的切片缓冲液填充振动切片机腔室，然后将第一个胚胎用超级胶水固定在振动切片机载物台上，使刀片与动眼神经核和眼睛保持平行。

当万能胶干燥后，将振动切片机的载物台浸入液体中，使胚胎朝向远离刀片的方向，并使用新的振动切片刀片切出400至450微米厚的切片。每获得一片切片，即用无菌移液管将其转移至冰冷的切片缓冲液中，并利用荧光解剖显微镜挑选出含有动眼神经核和眼睛的切片。

使用无菌移液管将切片转移至细胞培养插件中，放入6孔板内，每孔加入1.5毫升培养基，将6孔板置于37摄氏度培养箱中。从底部载片上清除残留的琼脂糖，并用瞬干胶将下一个胚胎固定于载片上，继续切片并收集，直至所有胚胎均完成切片和接种。随后，在72小时内每隔30分钟使用相差显微镜和荧光显微镜对切片进行成像观察。