将人诱导性多能干细胞分化为脑微血管内皮细胞

从一个含有在添加 Rho 激酶抑制剂的培养基中培养的人诱导性多能干细胞（iPSCs）的多孔板开始，该抑制剂可促进细胞存活。

用含有营养物质和生长因子的基础培养基替换原有培养基。

孵育以促进iPSCs增殖并分化为前体细胞。

用添加了成纤维细胞生长因子和视黄酸的分化培养基替换该培养基，然后孵育。

生长因子促进前体细胞分化为微血管内皮细胞，而视黄酸则促进紧密连接蛋白的合成。

使用酶-EDTA 溶液洗涤并处理细胞，使细胞脱落，形成单细胞悬液。

离心以收集细胞并去除上清液。然后，将细胞重悬于新鲜的分化培养基中。

将该细胞悬液接种至包被有胶原蛋白和黏附蛋白的多孔板中。

孵育以促进细胞黏附，使细胞间形成紧密连接，类似于脑微血管内皮细胞。

为了诱导人iPSCs向BMEC分化，先用DPBS洗涤汇合的iPSC培养物一次，然后在37摄氏度下用适当体积的含EDTA的酶溶液孵育细胞约五分钟。

获得单细胞悬液后，通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于适量的干细胞培养基中，加入10 µM ROCK抑制剂后进行细胞计数。

将细胞稀释至浓度为1.56 × 10⁴ 个细胞/立方厘米，每孔接种2毫升细胞悬液至6孔平底培养板的各个孔中。在细胞培养箱中培养24小时后，弃去每孔中的上清液，更换为E6培养基，并将培养板放回培养箱继续培养4天。

为纯化iPSC来源的BMEC，需在传代培养板中每孔加入适量新配制的IV型胶原蛋白和纤连蛋白溶液进行包被，并在37摄氏度下孵育至少两小时。

分化第6天，通过离心收集细胞，并将细胞沉淀重悬于适量的新鲜人内皮无血清培养基中，该培养基需添加B27、碱性成纤维细胞生长因子和视黄酸。将细胞接种至经胶原蛋白和纤连蛋白包被的24孔平底培养板的每个孔中。