利用iPSC来源的前体细胞生成血脑屏障芯片

取一个微流控芯片，其上设有相互重叠的、基质包被的通道，并由多孔膜隔开。

在上通道中接种iPSC来源的神经前体细胞。孵育以促进细胞贴壁，随后洗去未贴附的细胞。

接下来，将iPSC来源的脑微血管内皮细胞接种至底部通道中。

倒置芯片并进行孵育，使内皮细胞贴附于底部通道膜的一侧。

接下来，翻转芯片以使细胞附着在通道的下侧，形成单层管状结构。用细胞专用培养基清洗两个通道。

在上通道中持续灌注神经分化培养基，在下通道中持续灌注内皮细胞培养基。

内皮细胞利用培养基中的生长因子成熟并形成类似血管的紧密连接，从而构成血管的血液侧。

神经营养因子促进神经前体细胞分化为多种脑细胞，形成脑侧。这些细胞与内皮细胞相互作用，在芯片上形成血脑屏障。

首先，将装有已制备芯片的培养皿移至生物安全柜中。使用P200移液器，向进样口加入200 µL神经分化培养基，并从出样口缓慢吸取液体，轻柔地冲洗两个通道。注意避免接触进样口和出样口，小心吸除芯片表面多余的培养基液滴。

轻轻振荡细胞悬液，以确保细胞悬液均匀。为了将iPSC来源的神经前体细胞接种到上层通道以形成脑侧，取一支含有30至100微升细胞悬液的P200吸头（细胞浓度为每毫升1 × 10⁶个细胞），将其插入上层通道入口，然后轻轻从移液器上释放吸头，缓慢加入细胞悬液。

取一个空的P200移液枪，按压活塞，插入顶部通道出口，小心地将单细胞悬液吸入枪头中。将芯片转移至显微镜下，检查顶部通道内细胞分布的接种密度是否均匀。确认细胞密度达到约20%覆盖率后，立即将芯片放入37摄氏度的培养箱中孵育两小时。

随后，向入口加入新鲜的神经分化培养基，以冲洗未贴壁的细胞，并用移液器从出口收集液体。将细胞置于37摄氏度下静置培养，每天更换神经分化培养基。在iNPCs贴壁后或接种后的次日，将含有制备好的芯片的培养皿移至生物安全柜中。用200微升内皮细胞培养基轻轻冲洗底部通道。

避免接触端口，小心地从芯片表面吸去多余的内皮细胞培养基液滴，确保两个通道中均保留培养基。轻轻振荡细胞悬液，以保证细胞悬液均匀。使用P200移液枪吸取30至100微升浓度为14至20 × 10⁶ 个细胞/毫升的iPSC来源的脑微血管内皮细胞悬液，将枪头插入底部通道的入口。

实现功能性屏障特性的最关键步骤是脑微血管内皮细胞的接种。必须以适当的密度接种细胞，以避免气泡形成，并确保细胞在器官鞘内均匀分布。

用带有空吸头的P200移液器按下压杆，插入底部通道出口，然后缓慢释放移液器压杆，将单细胞悬液小心地经由底部通道吸出。吸取芯片表面多余的细胞悬液。避免直接接触进样口和出样口，以确保通道内的细胞悬液不会被吸出。将芯片转移至显微镜下检查接种密度。

底部通道中充满细胞，细胞之间无可见间隙。确认细胞密度正确后，将细胞接种至其余芯片中。为使细胞贴附于底部通道上方的多孔膜上，需将每片芯片倒置，并置于芯片支架中静置。