建立大鼠脊柱背根神经节原代细胞培养

取一段大鼠脊柱，在其两侧各做一切口，并做一横向切口。

去除背部肌肉和椎骨的背侧部分。

取出脊髓。

沿腰椎两侧辨认背根神经节（DRGs）。

背根神经节（DRG）包含被胶质细胞包围的神经元。

切除背根神经节并收集到培养皿中。用无血清培养基反复清洗组织。

将背根神经节转移至含有胶原酶溶液的培养板中并进行孵育。胶原酶可降解细胞外基质。

用缓冲液洗涤。加入胰蛋白酶-EDTA，孵育以破坏细胞间连接，使细胞松散脱落。

将DRG转移至离心管中，离心后弃去上清液。

用培养基重悬组织，并反复吹打以释放细胞。

将细胞转移至聚合物包被的培养板孔中，以促进细胞贴附。

移除培养基，并加入含有抑制剂和生长因子的新鲜培养基。

抑制剂可限制胶质细胞增殖，而生长因子则促进神经元生长。

从一只出生两周至三周大的大鼠躯干中取出腰段背根神经节。首先，在脊柱两侧各做一道切口，并在腰椎前端做一道横向切口，以标记腰椎的头端范围。接着，使用骨剪钳去除脊柱的背侧肌肉。然后，去除椎骨的背侧部分，暴露脊髓，再使用解剖剪和镊子将脊髓移除。

通过从最后一根肋骨开始计数椎骨来确定腰段背根神经节（DRG）。本图显示了椎骨的位置。使用显微剪刀采集L1至L6共12对腰段背根神经节。去除附着的神经纤维以提高培养纯度。将每个腰段背根神经节转移至含有2毫升冰上预冷的无血清培养基的35毫米培养皿中。

将含有背根神经节（DRG）的35毫米培养皿转移至超净工作台中，用无血清培养基通过移液管冲洗DRG三次。使用无菌镊子将DRG转移至一个新的含有2毫升无菌I型胶原酶A的35毫米培养皿中。将组织置于胶原酶溶液中，放入37°C细胞培养孵育箱内孵育30分钟，以开始细胞的消化分离。

孵育结束后，吸除胶原酶溶液，并用 2 毫升 Hank's 平衡盐溶液将背根神经节（DRG）清洗三次。接着，向培养皿中加入 2 毫升预热的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液，于孵育箱中消化 DRG 30 分钟，操作同前。消化完成后，使用玻璃移液管将含有 DRG 的 2 毫升溶液转移至 15 毫升离心管中。

背根神经节可能会黏附在玻璃移液管上，因此该步骤应小心操作。为避免背根神经节丢失，可将含有背根神经节的溶液保留在玻璃移液管的锥形末端，并缓慢但不间断地将溶液转移至离心管中。

接下来，在 4 摄氏度下以 290 × g 离心 5 分钟。离心后，弃去上清液，并加入 2 毫升无血清培养基重悬背根神经节（DRG）。最后一次离心后，使用 2 毫升预温的培养基重悬组织，重复洗涤两次。

使用先前制备的无菌火焰抛光移液管手动吹打 DRG 约 60 次。接着，从 CO2 培养箱中取出每孔含有 1 毫升培养基的聚-L-赖氨酸包被的 24 孔板。吸除培养皿中已孵育的培养基。

将一只大鼠的DRG细胞接种至四个孔中，每孔接种密度约为500,000个细胞。次日，更换培养基，加入含10 µmol/