利用基因工程改造的腺相关病毒转导原代小鼠中脑神经元

从盖玻片上的小鼠胚胎中脑细胞培养物开始。

在神经元特异性启动子驱动下，使用编码荧光钙离子指示剂复合物的基因工程腺相关病毒进行处理。

孵育以促进病毒吸附与内化。

移除培养基以去除未结合的病毒，然后加入培养液并进行培养。

内化的病毒在细胞核中释放其基因组，神经元特异性启动子驱动钙指示剂复合物仅在初级神经元中表达。

这些复合物包含一种荧光蛋白，该蛋白标记有钙结合蛋白和一个 M13 肽段。

将盖玻片转移至含有富含钙离子记录缓冲液的培养皿中，随后放入记录室进行活细胞共聚焦成像。

引入谷氨酸记录缓冲液，使谷氨酸与离子通道结合，从而导致钙离子内流。

这些离子与复合物结合，导致构象变化并发出荧光。

在活体成像中，明亮的神经元表明存在病毒感染。

每皿加入含 1 微升 hSyn-GCaMP6f AAV 的无血清 DMEM 培养基 1 毫升，开始准备。吸除各皿中的细胞培养基，更换为 1 毫升上述制备的含 hSyn-GCaMP6f 的 DMEM 培养基。将培养皿放回 37 摄氏度培养箱中孵育 1 小时。

孵育后，吸除含 AAV 的培养基，更换为 3 毫升细胞培养基。将培养皿置于 37 °C 培养 5 至 7 天，在此病毒感染期间每 2 至 3 天更换一次培养基。

根据文稿说明，配制1升HEPES记录缓冲液、200毫升20微摩尔谷氨酸记录缓冲液和200毫升10微摩尔NBQX记录缓冲液。

用3毫升记录缓冲液填充一个无菌的35毫米培养皿。从培养箱中取出含有感染培养物的培养皿，然后用尖头镊子小心夹住一张盖玻片的边缘，将其转移至含有记录缓冲液的培养皿中。

将剩余的盖玻片连同培养基放回37摄氏度培养箱中，并将含有记录缓冲液的培养皿转移至共聚焦显微镜。启动成像软件。在软件初始化的同时，启动蠕动泵并将管路插入记录缓冲液中。随后，将流速校准至2毫升每分钟。

用精细镊子将感染的盖玻片从培养皿转移到记录浴槽中。使用10倍水浸物镜和明场照明，找到焦平面并寻找神经元胞体密度较高的区域。然后切换至40倍物镜并重新对焦样本。

在染料列表窗口中选择并应用 AlexaFluor 488。为防止荧光染料过度曝光和光漂白，应从较低的 HV 和激光功率设置开始。

对于 AlexaFluor 488 通道，将HV设为 500，增益设为 1x，偏移设为 0。将 488 激光线的功率设为 5%。将针孔尺寸增大至 300 微米，并使用“聚焦 x2”扫描选项，以将发射信号最佳调整至未饱和水平。随后可进一步调节各通道参数，以获得最佳可见效果。

显微镜参数优化后，移动载物台以找到一个包含多个表现出GCaMP6f荧光自发变化的细胞区域，并将焦平面调整至所需的成像层面。

使用“裁剪矩形”工具将成像帧裁剪至可实现略小于一秒帧间隔的尺寸。将间隔窗口设置为1.0，将num窗口设置为600。

要采集时间序列视频，请选择“时间”选项。然后，使用“XYt”扫描模式开始成像。观察成像进度条，并在适当的时间点将灌流液从HEPES记录缓冲液切换至20 µM谷氨酸记录缓冲液。

成像完成后，点击“系列完成”按钮，保存最终的t系列视频。继续灌注谷氨酸5分钟，使培养的神经元暴露于谷氨酸的总时长达到10分钟。对每一张待成像的盖玻片重复此过程。