分离感觉神经元并与自然杀伤细胞共培养

在冰冷的含血清培养基中取一个背根神经节（DRG），即感觉神经元的簇集，以在后续处理过程中保护神经元。 

离心，然后移除上清液。

加入含有消化酶的磷酸盐缓冲液，并在轻微振荡条件下孵育。

这些酶可解离细胞外基质（ECM）和背根神经节（DRG）组织，使细胞松散。

加入含血清的培养基以灭活酶。

离心，然后弃去上清液。

用移液器将DRG重悬，并使用尺寸逐渐减小的移液器对组织进行机械解离，以获得单细胞悬液。

将细胞铺在牛血清白蛋白的密度梯度上。

离心。神经元沉降至底部，形成沉淀。

弃去含有组织碎片的层。

用培养基重悬神经元。

将神经元加入经细胞外基质包被的培养皿中，并进行孵育。

移除培养基并加入自然杀伤细胞或 NK 细胞。

加入培养基以共培养并研究这些细胞之间的相互作用。

将DRG收获至一个装有10毫升冰上预冷的含补充剂DMEM的15毫升圆锥形离心管中。随后在室温下以200 g 离心5分钟，并吸去上清液。加入250微升PBS，其中含有1毫克/毫升的IV型胶原酶和2.4单位/毫升的Dispase。将DRG与胶原酶-Dispase溶液在轻度振荡条件下孵育80分钟。

为了灭活酶，加入 5 毫升添加补剂的 DMEM 培养基，并以 200 g 离心溶液。5 分钟后，用移液枪小心吸去上清液，保留约 100 微升上清液以避免细胞意外丢失。接着，向细胞中加入 1 毫升添加补剂的 DMEM，并使用移液枪和三支尺寸递减的玻璃巴斯德吸管，轻柔地将背根神经节（DRG）吹打成单细胞悬液。

使用 P200 移液器，将含有神经元的匀浆后神经节悬液沿管壁加入 BSA 梯度中。然后，将离心机的加速度和减速度调至最低，以 200 g 离心 12 分钟。离心结束后，用移液器吸除所有上清液，并将细胞重悬于 500 微升的 Neurobasal 培养基中。

在经层粘连蛋白包被的平底96孔板中，每孔接种10,000个神经元。为促进神经元贴壁，将96孔板于37摄氏度培养过夜。开始共培养时，缓慢移除神经元培养物中的Neurobasal培养基，并向每孔神经元培养物中加入10⁵个NK细胞。