构建人角膜成纤维细胞与神经元的三维共培养模型

取人角膜成纤维细胞。

将它们转移至含有培养基的多孔板中的膜插件内。

向膜插件中加入培养基。孵育以使成纤维细胞贴附于插件上。

接下来，在膜插件和储液槽中更换为含有维生素C的培养基。

孵育。维生素C可刺激成纤维细胞分泌并组装三维细胞外基质。

将人神经母细胞瘤细胞悬液加入成纤维细胞上。

孵育，使神经母细胞瘤细胞贴壁。

现在，向细胞中加入含有视黄酸的培养基，并向储液槽中补充新鲜培养基。 

孵育。视黄酸可诱导神经母细胞瘤细胞分化为神经前体细胞。

接下来，移除培养基。向储液池中加入新鲜培养基。向膜插件中加入含有神经营养因子的培养基，并进行孵育。

神经营养因子诱导前体细胞分化为神经元，从而构建人角膜成纤维细胞与神经元的三维共培养模型。

为了组装三维结构，首先传代并计数人角膜成纤维细胞。然后，将约1 × 10⁶个HCF接种到具有0.4微米孔径的聚碳酸酯膜插入物上。向构建物顶部加入1.5毫升新鲜培养基。接着，用移液器向每个构建物底部加入另外1.5毫升相同的培养基。

24小时后，向每个构建物的顶部和底部加入1.5毫升添加了0.5毫摩尔维生素C的培养基。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养三周，每隔一天添加含有维生素C的新鲜培养基。这将刺激细胞分泌并组装其自身的细胞外基质。三周后，在先前组装好的三维构建物顶部接种8×10³个SH-SY5Y人源神经母细胞瘤细胞。

在此步骤中准确计算细胞数量至关重要，并且在开始细胞分化前需预留 24 小时。

孵育24小时后，通过加入含10%胎牛血清（FBS）和10微摩尔视黄酸的1.5毫升EMEM培养基，启动SH-SY5Y细胞的分化。然后，将含有维生素C的1.5毫升培养基加入到构建物的底部。视黄酸对光敏感，因此该步骤应在避光条件下进行。

五天后，当细胞进入分化阶段时，在构建物顶部加入含有2纳米摩尔BDNF和1%抗生素-抗真菌剂的1.5毫升无血清培养基。在构建物底部加入新鲜的维生素C补充培养基。继续培养细胞两天后，进行后续分析处理。