大鼠皮层神经元中丝状肌动蛋白点状结构的定量分析

取大鼠原代皮层神经元置于聚合物包被的玻璃底培养皿中。

用多聚甲醛固定神经元以保存细胞结构。

洗去多余的甲醛溶液。

加入非离子型去污剂以透化细胞。

使用靶向结构蛋白丝状肌动蛋白（F-actin）的绿色荧光染料对细胞进行染色。

去除多余的染色剂。

使用封闭剂以防止非特异性抗体结合。

使用靶向树突蛋白的一抗进行孵育。

去除未结合的抗体。

加入红色荧光染料标记的二抗以结合一抗，洗去未结合的过量抗体。

加入荧光染料以染色细胞核。去除未结合的染料。

加入抗荧光淬灭剂以防止荧光染料发生光漂白。

使用荧光显微镜拍摄神经元的图像。

在标记的树突内识别富含F-肌动蛋白的区域。

使用软件计数 F-actin 簇集或斑点，并手动追踪树突长度，以计算 F-actin 密度。

在室温下用 4% 多聚甲醛固定细胞 15 分钟，随后用 PBS 洗涤两次。接着用含 0.1% Triton X-100 的 PBS 在室温下对细胞进行 5 分钟的透化处理，并在室温下用特异性标记 F-actin 的染料对细胞进行染色。20 分钟后，用 PBS 冲洗细胞两次，并用 10% 正常山羊血清封闭非特异性细胞表面染色。

孵育结束后，在4摄氏度条件下用鸡多克隆抗MAP2抗体对细胞进行过夜标记。次日早晨，用PBS洗涤细胞两次，然后用相应的二抗进行标记。

室温孵育两小时后，再次用 PBS 清洗细胞，并在室温下用 10 微升 Hoechst 染色 3 分钟。随后，用 PBS 最终清洗细胞两次，再加入 100 微升抗荧光淬灭剂保存。

染色后三天内，打开荧光显微镜并选择20倍物镜。接着，在显微镜软件中将图像像素尺寸设置为1600 × 1200，图像分辨率为0.17微米/像素，缩放倍数设为1倍。将细胞培养皿转移至显微镜载物台上，通过绿色和红色荧光通道获取共标记的F-actin与MAP2神经元的图像。

当所有图像采集完成后，从绿色、红色和蓝色通道中各选择五张具有清晰树突分支的单个神经元图像，并利用连续的 MAP2 免疫荧光标记来鉴定二级树突节段中富含 F-actin 的结构。将所选图像区域水平旋转，并复制粘贴该区域作为新图像。

然后，扣除图像背景荧光，并使用软件计数亮绿色 F-肌动蛋白点状结构的数量。由经过训练的独立观察者测量所选树突节段的长度，随后将点状结构数量和树突节段长度数据导出至电子表格文件中。

务必确保观察者将每个选定片段中树突干染色平均强度至少高出50%的F-肌动蛋白阳性点状结构纳入统计。

最后，根据公式计算密度，将数据表示为每10微米树突长度上的F-肌动蛋白斑点数量。