在小鼠全胚胎培养的神经管封闭
October 21st, 2011
允许直接药理操纵小鼠胚胎神经胚绕过产妇代谢的方法描述。可适应的技术，来研究神经胚形成的不同方面，不同的时间点和药理代理人。
该程序的总体目标是监测小鼠胚胎的事件，在可以定义条件的额外子宫环境中转动神经轴伸长和神经管闭合。这是通过在妊娠或胚胎第 8.5 天首先从麻醉的怀孕小鼠身上去除子宫角来实现的。接下来，从子宫中取出单个小鼠胚胎，其卵黄囊和大部分蜕膜完好无损。
然后修剪掉多余的胚胎蜕膜组织，保持外胎盘锥体完好无损。该程序的最后一步是将卵黄囊中的胚胎转移到装有培养基的滚瓶中，无论是否经过药物测试，并在培养箱中培养胚胎 18 至 24 小时，并持续放气。最终，可以获得结果，显示体节的逐渐增加、神经皱襞的并置以及胚胎变成熟悉的胎儿位置的 c 曲率而闭合。
这种方法可以帮助回答该领域的关键问题，例如正常神经管闭合涉及哪些分子通路。哪些药物或补充剂可以帮助促进正常尿化，尤其是在携带基因突变的胚胎中，这些突变使它们容易患上神经管缺陷或 NTD。这项技术的视觉演示至关重要，因为解剖的步骤可能非常具有挑战性。
胚胎很小，很容易损坏，对卵黄囊的损伤会损害 som 可能会增加、转动和循环系统的发育，从而阻止成功的结果。首先，通过在 37 摄氏度下解冻雄性大鼠血清来制备培养基。接下来 e 在 30 摄氏度下灭活大鼠血清 55 分钟。
然后以 10， 000 RPM 的速度将其旋转 5 分钟。在室温下，去除上清液，并与不含酚红和高葡萄糖的 DMEM 以一比一的比例混合。使用 0.45 微米针式过滤器对培养基进行消毒。
分离子宫并将其放入装有盐水的培养皿中以去除胚胎。首先，用生理盐水冲洗子宫以去除多余的血液并从外部去除多余的脂肪。将其转移到具有室温的干净培养皿中，用 tyro 盐水改善在立体显微镜下的可视化，双手稳定在载物台上。
使用小剪刀或细镊子将子宫剥离并分离每个胚胎。将细镊子插入子宫壁和蜕膜之间的空间，并以最小的张力剥开子宫壁，以避免卵黄袋破裂。接下来，确定落叶的方向，使胎盘背对着您。
然后用镊子沿线切开，将蜕膜的深色部分与较浅的部分分开。小心不要切得太深。完成胎盘与橡木囊顶部的分离。
小心不要撕裂外胎盘锥或 EPC。此时，橡木袋上的 riker 膜应该是可见的。从蛋黄袋中取出 Riker 膜是手术中最困难的部分，需要耐心和稳定的手。
为了在不损坏下面的蛋黄袋的情况下小心地去除 riker，请继续去除整个蜕膜。小心不要刺穿蛋黄袋，轻轻捏住 riker 膜并将其从 EPC 上剥离，将其去除。如果 EPC 受损或从橡木囊中分离，胚胎将无法从 E 8.5 正常翻到 E 9.5。
去除 Riker 膜后，应该可以通过橡囊很容易看到胚胎。通过沿一侧计数体节来暂存胚胎，从耳囊下方开始，用剪刀在尾部结束。切下塑料移液管的末端以用于胚胎，而不会损坏橡木袋。
每个胚胎用 1 毫升培养基填充干净的滚筒瓶。根据所使用的滚瓶类型，每个瓶子中最多可以装载 3 到 6 个胚胎。使用切割的移液管，将胚胎转移到装满培养基的滚瓶中，尽可能少地携带 tyros，以免稀释培养基。
将橡胶塞连接到玻璃滚瓶的顶部。将滚瓶插入滚瓶培养桶中，以便在塞子和滚筒之间形成紧密密封。连接好所有瓶子后，用橡胶塞密封桶中的任何空槽。
然后激活滚轮。接下来，打开预混 CO2 O2 罐，将其调整到大约 2 PSI，以便出口阀每秒释放一个气泡。对于 E 8.5、E 10 胚胎，应使用 20%O 2 和 5%CO 2 。
确保将培养箱设置为 37 摄氏度，并盖上或关闭培养箱，以便胚胎避光。为了评估胚胎发育，定期检查它们是否添加了体节、翻身的进展和培养两到三个小时后神经管闭合的程度，如果需要，添加药物抑制剂或其他治疗。孵育完成后，关闭气体，停止滚轮并从培养箱中取出瓶子。
将胚胎转移回培养皿中的 tyros 或 PBS 在立体显微镜下，蛋黄袋应该看起来像气球一样，应该可以看到心跳，并且循环应该很明显。通过在 EPC 附近切一个孔，然后将蛋黄袋和羊膜翻转到胚胎的头部和臀部，从胚胎中取出橡木袋。剪断脐带，将卵黄囊与胚胎分开。
最后，检查胚胎是否存在数量和神经管缺陷，例如开放的颅褶皱、面部不完全闭合和/或开放的神经孔胚胎可以根据多种形态发生变化的泰勒分类进行分期。在解剖时，这里说明了胚胎在滚子培养前后的外观。胚胎应处于未转动的配置中，其中尾巴位于头部折叠的后面。
培养 24 小时后，胚胎应该已经完成翻身，使它们处于 C 形弯曲的胎儿位置，即尾巴在头部前面。这张图片在顶行显示了未添加抑制剂的胚胎的发育。底行显示了 A 行激酶抑制剂 Y 2 76 32 的药理学作效果，A 激酶抑制剂 Y 2 76 32 是已知的在酸化过程中收敛延伸的抑制剂。
这种抑制剂导致胚胎沿盏腔轴缩短，并抑制颅神经皱襞闭合。我们的数据表明，增加 Y 2 7 6 3 2 的剂量逐渐损害颅皱襞闭合并缩短体轴，这与下游行的作用一致。A 颅神经信号传导和收敛延伸 一旦掌握，解剖技术可以在 60 到 90 分钟内完成，一窝 6 到 12 个胚胎。
观看此视频后，您应该对培养妊娠第 8 天半至第 10 天的小鼠胚胎所需的步骤有很好的了解，以便在系统水平上研究发育机制。
概述
本文描述了一种在神经管形成期间直接对小鼠胚胎进行药理操控的方法，使研究人员能够绕过母体代谢。通过改变药理药剂和时间，该技术可用于探索神经管形成的各个方面。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
- 胚胎学
背景
- 理解神经管形成对于洞察神经管缺陷至关重要。
- 小鼠胚胎作为研究早期发育过程的模型。
- 药理操控可以揭示神经发育中涉及的分子通路。
- 胚胎处理中的挑战需要精确的技术以避免损伤。
研究目的
- 在受控环境中监测神经轴延长和神经管闭合。
- 研究正常神经管闭合涉及的分子通路。
- 评估药理药剂对具有神经管缺陷遗传倾向的胚胎的影响。
使用的方法
- 在胚胎第8.5天从孕鼠中取出子宫角。
- 分离具有完整卵黄囊的胚胎并修剪额外的胚胎组织。
- 在含或不含药理药剂的培养基中培养胚胎18至24小时。
- 评估体节增加、神经褶对接和神经管闭合。
主要结果
- 成功的胚胎操控允许观察发育里程碑。
- 药理药剂影响神经管闭合的进程。
- 该技术的视觉文档突出了胚胎处理的挑战。
- 结果有助于理解基因突变对神经发育的影响。
结论
- 所描述的方法为研究神经管形成提供了宝贵的工具。
- 获得的见解可以为解决神经管缺陷的策略提供信息。
- 未来的研究可以在此技术基础上探索其他药理效应。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables direct pharmacological manipulation of mouse embryos in a controlled ex utero environment, isolating intrinsic fetal effects from maternal metabolism. It supports mechanistic de-risking of developmental pathways relevant to congenital disorders and provides a scalable platform for target validation in early discovery. The approach enhances predictive confidence by allowing dose-response analysis of compounds on neurulation phenotypes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in neural tube closure pathways using genetic or pharmacologic perturbation.
- Operational Value: Provides a reproducible system for functional target validation independent of maternal pharmacokinetic variables.
- Strategic Value: Supports predictive confidence in target selection by linking molecular mechanisms to morphogenetic outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative phenotypic readouts such as somite addition, neural fold apposition, and tube closure status.
- Operational Value: Standardizes embryo culture conditions for consistent compound screening across laboratories.
- Strategic Value: Enables scalable assessment of compound effects on developmental trajectories for lead identification.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models human neurulation processes to evaluate translational relevance of targets in neural tube defect etiologies.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery through preclinical validation using staged embryonic timepoints.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by de-risking mechanistic uncertainty in developmental pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling mechanistic probing of neurulation prior to lead optimization, supporting go/no-go decisions based on developmental toxicity and target engagement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of molecular pathways involved in neural tube closure through controlled pharmacological or genetic manipulation.
- Screening: Delivers assay-ready embryos with quantifiable morphogenetic endpoints for compound evaluation.
- Analytics: Provides measurable outputs including somite count, turning progression, and closure status for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by modeling human-relevant neurulation stages.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for developmental biology screening across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in developmental pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of embryo handling and culture procedures.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets associated with developmental disorders.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on neurulation and axis elongation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical dissection and embryonic staging under stereo microscopy.
- Dependent on roller incubator apparatus and gas-controlled culture environment for consistent O2/CO2 levels.
- Necessitates standardized medium preparation including serum inactivation and filtration to ensure embryo viability.
- Involves adaptation considerations across mouse strains and genetic backgrounds affecting neurulation timing.
- Limited by embryo fragility and technical skill required to maintain yolk sac integrity during dissection.
