活细胞成像 枯草芽孢杆菌 和 肺炎链球菌 使用自动延时显微镜技术

本实验的总体目标是利用荧光显微镜对活细胞在生长和分裂过程中的动态进行成像，从而研究细胞历史及其谱系对细菌细胞发育的影响。该目标首先通过将细胞从营养浓度相对较高的液体培养基转移至液体饥饿培养基来实现。随后，将细菌细胞接种到显微镜载玻片上，使其生长形成微菌落。

制备单层细胞。随后记录延时荧光显微镜视频。最后对视频进行处理并分析数据。

最终，可以通过延时荧光显微镜观察单个细菌细胞随时间的发育过程。该技术相较于流式细胞术和常规显微镜等现有技术的主要优势在于，能够实时监测单个细胞中蛋白质动态、细胞行为及其发育过程。本实验操作将由我实验室的博士生 cone 演示。准备 B. subtilis 时，从 −80 °C 保存的菌种中接种细胞至 10 毫升无菌摇瓶中的延时显微镜培养基（TLM 培养基），根据需要添加抗生素，在 30 °C、225 RPM 条件下过夜培养。次日早晨，将细胞以 1:10 的比例转接至预热的无抗生素化学成分明确培养基（CDM）中，继续培养至对数中期，约需四小时。测定菌液在 600 纳米处的吸光度，并将细胞稀释至 A600 约为 0.035。

使用CDM。该OD值可确保将单个细胞以适当的细胞间距点样在显微镜载玻片上，用于延时显微镜观察。在细胞达到对数生长中期前一小时进行操作。

用70%乙醇和水清洁两张载玻片，以准备显微镜载片。取下基因框架（gene frame）上的一个塑料盖片时，注意不要导致框架另一侧的塑料盖片松动。将基因框架固定在一张玻璃载片中央，先将其一侧粘附到载片上，再用指甲轻轻引导其余部分贴合。

使用微波炉将150毫克高分辨率低熔点琼脂糖溶解于10毫升CDM中，确保琼脂糖完全溶解，以防止背景荧光。用移液器将500微升温热的含琼脂糖CDM加入基因框架中央，确保包括边缘在内的整个区域被完全覆盖。

操作需迅速，以防止Aros过度干燥。将第二片载玻片盖在已加入Aros CDM的基因框上，尽量避免产生气泡。将此夹心结构水平置于4°C环境中静置45分钟，使Aros充分凝固。

待琼脂凝固后，小心地移去上层玻璃。使用剃刀刀片切割出约五毫米宽的琼脂条，用于细菌生长。每张载玻片最多可使用三条琼脂条，两侧间隔约四毫米。

这些空间将提供对Blu生长至关重要的空气。小心移除基因框架上的第二层也是最后一层塑料覆盖膜，以暴露其黏性面。取约2.5 µL液体中的单细胞，从农杆菌垫的顶部开始，加载到固体培养基上，注意不要触碰该区域。

用移液器吸头轻轻倾斜载玻片，使培养基均匀铺展。将干净的显微镜盖玻片置于基因框架上，使其完全贴附盖玻片。在细胞加载完成后，用指甲轻轻施加压力。

必须等待液体充分干燥，以避免细胞游动和多层生长。然而，如果细胞干燥时间过长，则将难以形成微菌落单层。因此，玻片干燥所需的时间取决于具体实验，无法精确测定。

因此，当然需要对其有所了解，以防止在延时实验的最初几小时内出现自动对焦问题。在开始延时显微成像前，将载玻片在30摄氏度下预热一小时。环境培养箱至少需提前两小时预热。在实验开始前，根据您的实验设置选择合适的物镜滤光片和二向色镜。

对于长时间实验，务必在光源与样品之间放置紫外滤光片。此外，如果可能，使用中性密度滤光片阻挡部分激发光，以尽量减少曝光。根据具体的实验装置设置实验程序。

在正式实验之前，确定特定构建体所需的光照强度以及针对其他延时显微镜或细菌的自动对焦设置是十分必要的。较短的曝光时间和较低的激发光强度可最大程度减少荧光漂白和光毒性。自动对焦功能应使用观察光（scopic light）。最后，将制备好的载玻片放入显微镜预热的环境培养室中，在30摄氏度条件下监测单个细胞生长形成微菌落单层的过程。

一次成功的延时荧光实验将产生一个完全位于视野范围内的微菌落单层。在本视频实验结束时，左侧为明场图像，右侧可见荧光信号。

这是一个B Subtles微菌落的示例，其中一些细胞相互堆叠生长，使得难以准确追溯它们的谱系历史，也难以正确测量其荧光水平。观看本视频后，您应能够充分理解如何成功制备用于延时显微观察的显微样品，以及如何进行延时荧光显微镜观察。请使用BACE细胞进行实验。