Name: 活细胞成像枯草芽孢杆菌肺炎链球菌使用自动定时显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: 学习使用自动荧光延时显微镜对枯草芽孢杆菌和肺炎链球菌进行活细胞成像，观察单细胞生长分裂过程。该方法可追踪细胞历史对发育的影响，为微生物学研究提供重要工具。

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JWV 课题组的研究工作得到了欧盟玛丽·居里回归基金、Sysmo2 项目资助（NWO-ALW/ERASysBio）、Horizon 项目资助（ZonMW）以及 VENI 青年学者基金（NWO-ALW）的支持。OPK 课题组的研究工作得到了多项 STW 项目资助（NWO）、SYSMO1（IGdeJ）和 SYSMO2 项目资助、ESF Eurocores SynBio 项目资助（SynMod），以及 Kluyver 工业发酵基因组学研究中心和食品与营养顶尖研究所的支持。

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<li>Montero, L. lopis P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+of+the+flow+of+genetic+information+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatial organization of the flow of genetic information in bacteria.</a> Nature. 466, 77-77 (2010).</li>
<li>Avery, O. T., Macleod, C. M., McCarty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+chemical+nature+of+the+substance+inducing+transformation+of+pneumococcal+types%3A+Induction+of+transformation+by+a+desoxyribonucleic+acid+fraction+isolated+from+pneumococcus+type+III%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types: Induction of transformation by a desoxyribonucleic acid fraction isolated from pneumococcus type III.</a> J Exp. Med. 79, 137-137 (1944).</li>
<li>Hoskins, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+of+the+bacterium+Streptococcus+pneumoniae+strain+R6%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Genome of the bacterium Streptococcus pneumoniae strain R6.</a> J Bacteriol. 183, 5709-5709 (2001).</li>
<li>Martin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+recA+gene+of+Streptococcus+pneumoniae+is+part+of+a+competence-induced+operon+and+controls+lysogenic+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The recA gene of Streptococcus pneumoniae is part of a competence-induced operon and controls lysogenic induction.</a> Mol Microbiol. 15, 367-367 (1995).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

与其他许多单细胞技术不同，此处所述的时间序列荧光显微镜方法可用于追踪特定细胞的谱系历史、行为特征及分裂事件。结合荧光标记的靶向启动子或蛋白质，可在细菌发育过程中实时监测特定发育通路的激活情况，以及蛋白质的定位和动态变化。
如上所述，通过根据特定细菌的需求调整培养条件，可对不同细菌种类开展研究。我们遇到的唯一限制与生长条件和样品规模有关。由于环境密闭，实验过程中无法改变培养基条件。此外，每次实验最多可有效监测四种菌株。
考虑到一些关键步骤，此处描述的单细胞分析方法可轻松应用于任何自动显微镜。以下将概述这些关键步骤，详细信息请参见正文。常规准备：实验前检查特定细菌所需的自动对焦设置是明智之举。同样，如果可能，应提前确定荧光可视化的大致最佳设置。此外，遵循预先制定的时间表有助于及时准备好所有材料（例如提前预热显微镜腔室、编程显微镜参数、在细胞达到所需生长期前一小时制备载玻片，见图1）。B. subtilis 在TLM和CDM中的培养：TLM和CDM是化学成分明确的饥饿培养基，在其中B. subtilis仅缓慢生长。根据具体菌株的不同，细胞在培养基中的培养时间可能需要延长。缓慢生长可防止细胞相互堆叠。显微镜样品的制备：必须避免基因框架、载玻片与盖玻片之间产生气泡，以防止基于琼脂糖的培养基过度干燥。培养基与盖玻片界面同样需要注意。必须让细胞充分干燥，以防止细胞游动或形成多层生长。延时荧光显微镜观察：载玻片及环境腔室的预热至关重要，可避免严重的自动对焦问题。应选择位于琼脂垫中央的细胞，因为这些细胞在实验过程中最有可能保持在视野和焦平面内（前提是样品已充分干燥）。每项实验最多设置10个位置仍可正常工作。选定第一个目标细胞后，仅使用软件调节焦距（详见正文）。在实验开始的数小时内，应每隔30分钟检查一次细胞是否仍处于焦平面内。分析：在进行大规模分析之前，必须检查培养基背景在各荧光通道中的信号值是否相近。微小灰尘颗粒、培养基成分、镜头污渍或微小的琼脂糖团块可能导致局部荧光信号升高，从而使视频难以甚至无法分析。故障排除：若观察到细胞相互堆叠生长，可能是由于盖玻片过早封固，或培养基不适合微菌落单层生长。若目标细胞持续过早死亡，而载玻片上其他细胞正常分裂，则应检查是否已正确安装紫外滤光片。此外，在长时间实验中缩短曝光时间或降低光照强度也可能有所帮助。

<table><tbody><tr><td>基因框</td><td>ABgene有限公司</td><td>AB-0578</td><td>1.7 × 2.8 厘米</td></tr><tr><td>高分辨率低熔点琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4718</td><td></td></tr><tr><td>大片盖玻片</td><td>多家供应商</td><td></td><td>24 x 50 毫米</td></tr><tr><td>如需要，可使用膜染料，例如 FM&lt;sup&gt;&lt;/sup&gt; 5-95</td><td>Invitrogen</td><td>T23360</td><td>其他膜染料也可使用： &lt;a href=&quot;http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf&quot;&gt;http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>带有环境培养室的延时显微镜</td><td>多家供应商</td><td></td><td>在相应章节中查看我们设备的详细信息</td></tr></tbody></table>

活细胞成像 枯草芽孢杆菌 和 肺炎链球菌 使用自动延时显微镜技术

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

近年来，科学家们日益认识到，基于微生物群体实验所获得的平均数据并不能代表单个细胞的行为、状态或表型。由于这一新认识，单细胞研究的数量在持续增加（近期综述见1,2,3）。然而，目前应用的许多单细胞技术尚无法实现对某一特定单个细胞随时间推移的发育过程和行为进行连续监测（例如流式细胞术或常规显微镜技术）。
本文详细描述了一种在多项近期研究中使用过的显微镜方法4, 5, 6, 7，该方法可用于长期追踪并记录枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）单个细菌细胞在多代生长与分裂过程中的（荧光）信号。通过分析所获得的延时影像，可追溯源自同一共同祖先的细胞群体中单个细胞的发育历史，进而构建谱系发生树。这种延时荧光显微镜技术不仅可用于研究单个细胞的生长、分裂和分化过程，还可用于分析细胞历史及其谱系对特定细胞行为的影响。此外，延时显微镜特别适用于观察细菌细胞周期中基因表达动态变化及蛋白质的定位情况。本方法详细说明了如何制备细菌样品以及如何构建显微镜载玻片，以支持单个细胞生长形成微菌落。简而言之，将单个细胞接种于含有琼脂糖的固体培养基表面，在温度可控的环境培养室内，利用荧光显微镜观察其生长与分裂过程。在设定的时间间隔内采集图像，随后使用开源软件 ImageJ 进行图像分析。

本方案提供了一种利用自动荧光延时显微镜随时间监测不同细菌单细胞行为的逐步操作流程。此外，我们还提供了显微镜图像分析的指导方法。

在过去的几年中，科学家们日益意识到，从基于微生物群体的实验中获得的平均数据并不能……

本实验的总体目标是利用荧光显微镜对活细胞在生长和分裂过程中的动态进行成像，从而研究细胞历史及其谱系对细菌细胞发育的影响。该目标首先通过将细胞从营养浓度相对较高的液体培养基转移至液体饥饿培养基来实现。随后，将细菌细胞接种到显微镜载玻片上，使其生长形成微菌落。制备单层细胞。随后记录延时荧光显微镜视频。最后对视频进行处理并分析数据。最终，可以通过延时荧光显微镜观察单个细菌细胞随时间的发育过程。该技术相较于流式细胞术和常规显微镜等现有技术的主要优势在于，能够实时监测单个细胞中蛋白质动态、细胞行为及其发育过程。本实验操作将由我实验室的博士生 cone 演示。准备 B. subtilis 时，从 −80 °C 保存的菌种中接种细胞至 10 毫升无菌摇瓶中的延时显微镜培养基（TLM 培养基），根据需要添加抗生素，在 30 °C、225 RPM 条件下过夜培养。次日早晨，将细胞以 1:10 的比例转接至预热的无抗生素化学成分明确培养基（CDM）中，继续培养至对数中期，约需四小时。测定菌液在 600 纳米处的吸光度，并将细胞稀释至 A600 约为 0.035。使用CDM。该OD值可确保将单个细胞以适当的细胞间距点样在显微镜载玻片上，用于延时显微镜观察。在细胞达到对数生长中期前一小时进行操作。用70%乙醇和水清洁两张载玻片，以准备显微镜载片。取下基因框架（gene frame）上的一个塑料盖片时，注意不要导致框架另一侧的塑料盖片松动。将基因框架固定在一张玻璃载片中央，先将其一侧粘附到载片上，再用指甲轻轻引导其余部分贴合。使用微波炉将150毫克高分辨率低熔点琼脂糖溶解于10毫升CDM中，确保琼脂糖完全溶解，以防止背景荧光。用移液器将500微升温热的含琼脂糖CDM加入基因框架中央，确保包括边缘在内的整个区域被完全覆盖。操作需迅速，以防止Aros过度干燥。将第二片载玻片盖在已加入Aros CDM的基因框上，尽量避免产生气泡。将此夹心结构水平置于4°C环境中静置45分钟，使Aros充分凝固。待琼脂凝固后，小心地移去上层玻璃。使用剃刀刀片切割出约五毫米宽的琼脂条，用于细菌生长。每张载玻片最多可使用三条琼脂条，两侧间隔约四毫米。这些空间将提供对Blu生长至关重要的空气。小心移除基因框架上的第二层也是最后一层塑料覆盖膜，以暴露其黏性面。取约2.5 µL液体中的单细胞，从农杆菌垫的顶部开始，加载到固体培养基上，注意不要触碰该区域。用移液器吸头轻轻倾斜载玻片，使培养基均匀铺展。将干净的显微镜盖玻片置于基因框架上，使其完全贴附盖玻片。在细胞加载完成后，用指甲轻轻施加压力。必须等待液体充分干燥，以避免细胞游动和多层生长。然而，如果细胞干燥时间过长，则将难以形成微菌落单层。因此，玻片干燥所需的时间取决于具体实验，无法精确测定。因此，当然需要对其有所了解，以防止在延时实验的最初几小时内出现自动对焦问题。在开始延时显微成像前，将载玻片在30摄氏度下预热一小时。环境培养箱至少需提前两小时预热。在实验开始前，根据您的实验设置选择合适的物镜滤光片和二向色镜。对于长时间实验，务必在光源与样品之间放置紫外滤光片。此外，如果可能，使用中性密度滤光片阻挡部分激发光，以尽量减少曝光。根据具体的实验装置设置实验程序。在正式实验之前，确定特定构建体所需的光照强度以及针对其他延时显微镜或细菌的自动对焦设置是十分必要的。较短的曝光时间和较低的激发光强度可最大程度减少荧光漂白和光毒性。自动对焦功能应使用观察光（scopic light）。最后，将制备好的载玻片放入显微镜预热的环境培养室中，在30摄氏度条件下监测单个细胞生长形成微菌落单层的过程。一次成功的延时荧光实验将产生一个完全位于视野范围内的微菌落单层。在本视频实验结束时，左侧为明场图像，右侧可见荧光信号。这是一个B Subtles微菌落的示例，其中一些细胞相互堆叠生长，使得难以准确追溯它们的谱系历史，也难以正确测量其荧光水平。观看本视频后，您应能够充分理解如何成功制备用于延时显微观察的显微样品，以及如何进行延时荧光显微镜观察。请使用BACE细胞进行实验。

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在本论文中，我们提供了一套全面的实验方案，用于评估铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抗生素存活能力，通过将质粒转化至铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）和金黄色葡萄球菌（S.

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学习使用自动荧光延时显微镜对枯草芽孢杆菌和肺炎链球菌进行活细胞成像，观察单细胞生长分裂过程。该方法可追踪细胞历史对发育的影响，为微生物学研究提供重要工具。

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