分离单链DNA，双链DNA和RNA病毒使用羟基磷灰石色谱从环境社区

该视频演示了一种根据核酸组成分离混合病毒组合的程序。这使得能够研究复杂病毒组合的分类多样性和功能潜力。这里羟基磷灰石是磷酸钙的一种结晶形式，用于核酸的分离。

首先，填充羟基磷灰石柱并平衡纯化的病毒核酸，然后将纯化的病毒核酸施加到柱上，羟基磷灰石的带正电荷的钙离子与核酸亚型带负电荷的磷酸盐骨架之间的电荷相互作用将核酸与柱 Nick 结合。接下来，单链、D-N-A-R-N-A 和双链 DNA 依次用不同浓度的磷酸盐缓冲液表示。然后将所得核酸脱盐和浓缩，以准备通过 DNA 测序进行可视化、定量和鉴定 agros 凝胶电泳确认核酸种类可以分离，残留量小于 9%。

因此，该方法能够评估病毒群落的多样性和功能能力。大家好，我叫 Doug Fro，是 j Craig Venture Institute 的 Shannon Williamson 博士实验室的一名研究助理。今天，我将向您展示一种从环境病毒组合中分离单链 DNA、双链 DNA 和 RNA 的程序。

与现有方法相比，这种方法具有优势，例如使用靶向 DNA 或 RNA 的细胞核处理。羟基磷灰石色谱法具有捕获整个病毒群落的能力。这种方法使我们能够回答病毒生态学领域的几个问题。

例如，病毒群落的总基因补体或多样性是多少？当我们想在不牺牲遗传特征子集的情况下研究切萨皮克湾的整个 Rio Plankton 组合时，我们首先想到了这种方法。本实验所需的溶液应根据随附书面方案中的说明提前制备，包括 0.12 摩尔磷酸盐缓冲液、0.20 摩尔磷酸盐缓冲液、0.40 摩尔磷酸盐缓冲液和一种摩尔磷酸盐溶液。

在实验当天，所有磷酸盐缓冲液和水合羟基磷灰石均在 pH 值为 6.8 和水合羟基磷灰石的情况下，将所有磷酸盐缓冲液和水合羟基磷灰石置于 60 摄氏度的水浴中以平衡它们。通过制备用于分离病毒核酸的 econo 色谱柱开始此过程。将旋塞阀连接到经济柱的末端，并确保其关闭。

使用移液器将去离子水添加到色谱柱中，然后将盖子放在色谱柱顶部并反复倒置色谱柱以冲洗。倒掉水并重复几次洗涤。接下来，从 econ 柱上取下旋塞并高压灭菌以对其进行消毒。

旋塞阀不是高压釜，因为它会熔化。用离子水冲洗旋塞，然后再次用 70% 乙醇冲洗旋塞，并在高压灭菌后风干。装回旋塞并关闭它。

接下来，在通风橱中工作，向色谱柱中加入一毫升 sigma 涂层，并以滚动运动倒置色谱柱玻璃，如图所示。用 sigma 涂层涂层将最大限度地减少核酸对玻璃表面的粘附。在分离过程中，一个盐玻璃表面被涂覆。

打开旋塞阀，倒入锥形管中。接下来，要将色谱柱连接到循环水浴，请使用两个夹子将色谱柱连接到环形支架上。连接来自循环水浴的硅胶管，使水从水浴中流出是从下到上。

将温度设置为 60 摄氏度并开始循环。在实践中，色谱柱和管道将包裹在绝缘剂中，例如铝箔或泡沫管绝缘材料。为了最大限度地减少热损失，此处不显示此步骤。

为了更好地可视化程序，请关闭旋塞阀。使用移液器，加入 10 毫升不含 RNA 的无菌水。打开旋塞，让水排出。

然后在第二次洗涤后再次洗涤。用 10 mL 无菌 RNA 不含 0.12 摩尔磷酸盐缓冲液冲洗两次，并在两次洗涤之间倾析。该色谱柱现在已准备好用于羟基磷灰石色谱。

确保 econ 柱旋塞已关闭。然后，使用无菌的 2 mL 血清移液管，将 2 mL 准备好的重悬再水化羟基食欲缓慢添加到柱底部。更换色谱柱盖。

让羟基食欲在重力下稳定 30 分钟。这种方法需要注意细节。羟基胃食量柱以每分钟 0.25 至 0.5 密耳的速度处理。

因此，密切关注色谱柱非常重要，这样它就不会变干。30 分钟后，打开旋塞阀，将缓冲液排入废液容器中。关闭旋塞并丢弃流出物。

核酸与 0.12 摩尔磷酸盐缓冲液混合，最终体积为 500 μL，并在 60 摄氏度下孵育 10 分钟。这将使核酸平衡到色谱柱的温度，并通过去除可能存在的任何二级结构来增强不同核酸种类的分离。使用 2 mL 血清移液管，将核酸溶液快速涂抹于羟基食欲上，确保不会干扰色谱柱。

一旦整个 500 μL 流到色谱柱上，即可在色谱柱顶部添加少量 0.12 摩尔磷酸盐缓冲液，以防止其变干。让核酸与羟基食欲结合 30 分钟。结合孵育后，将 15 mL 锥形管置于层析柱下方。

然后打开旋塞阀并收集初始 500 μL 样品，其中包含单链 DNA。收集 500 μL 后，关闭旋塞阀。接下来，向羟基食欲中加入 6 毫升 0.12 摩尔磷酸盐缓冲液，确保不会干扰色谱柱。

然后打开旋塞，继续在上一步的同一 15 mL 试管中收集含有单线态链 DNA 的流出物。收集大约 6 毫升后，关闭旋塞阀。向试管中加入一体积的苯酚氯仿异戊醇溶液，涡旋剧烈混合，然后以 3， 500 倍 G 离心 15 分钟。

离心后，试管将包含两层。将包含单链 DNA 的顶部默许层转移到新的 15 mL 试管中，并将样品储存在室温下以洗脱和纯化 RNA。从色谱柱中加入 6 mL 0.20 摩尔磷酸盐缓冲液并收集流出物，然后再使用新的 15 mL 试管。然后进行苯酚氯仿提取。

对于单链 DNA 样品，使用 6 毫升 0.40 摩尔磷酸盐缓冲液重复此过程，以从色谱柱中洗脱和纯化双链 DNA。最后，去除色谱柱中残留的双峰链 DNA。再次重复此过程。

这次使用 6 毫升 1.00 摩尔磷酸盐缓冲液对核酸样品进行脱盐。通过在固定角转子中以 6， 000 GS 的温度在 30 摄氏度下旋转约 5 分钟，将每个样品的 4 至 5 毫升转移到配备 30， 000 截留分子量的 ultra 细胞膜浓缩物样品的 anon Ultra four 离心过滤装置中，至低于 500 μL。丢弃流出物后，将剩余的样品添加到过滤器中。

使用不含 RNA 的 1 种 XTE 缓冲液将体积增加到 4 至 5 mL。然后再次旋转，直到达到浓缩体积。离心后约 5 分钟，向过滤器中加入 4 至 5 mL RNA、游离 1 种 XTE 缓冲液并浓缩。

同样，重复此洗涤并额外 5 次，以完全脱盐核酸样品。样品完全浓缩和脱盐后，将剩余的核酸样品转移到无菌的 1.7 mL 微量离心管中。通过涡旋离心机加入 1/10 体积的乙酸钠、2 倍体积的 100% 乙醇和 1 微升糖蓝

A 28， 000 GS 4 摄氏度。60 分钟到肯特。确保不要打扰颗粒。

加入 300 微升 70% 乙醇，在 28， 000 GS 室温下离心 10 分钟，使其干燥，并将每个馏分重悬于适当体积的 RNA 中。游离 TE 缓冲液将等浓度的病毒核酸 M 13 MP 18、单链 DNA MS 2 单链、RNA FI 6 双链 RNA 和 lambda 双链 DNA 混合，然后使用羟基磷灰石色谱法分离，如本视频所示。如泳道 6 所示，将等浓度的 M 13 MP 18、单链 DNA MS 2、单链、RNA 5、6 双链、RNA 和 Lambda 双链 DNA 合并，并上样到羟基磷灰石柱上，如图所示。

使用 0.12 摩尔、0.18 摩尔、0.40 摩尔和 1.00 摩尔磷酸盐缓冲液，从羟基磷灰石柱中独立引入单链 D-N-A-R-N-A 和双链 DNA。使用 1 KB 的分子量标准来确认基因组大小。这些结果表明，该方法可用于成功分离单链 DNA、双链 DNA 和从一个组分到下一个组分残留小于 9% 的 RNA。

该方法还用于分离从切萨皮克湾内的病毒群落中分离的核酸，如图所示。使用磷酸盐缓冲液浓度分别为 0.12 摩尔、0.20 摩尔和 0.40 摩尔或 1.00 摩尔，分别使用泳道 1 中的高质量 DNA 梯和泳道 2 中的 1 KB 分子量标准来目视确认核酸的近似分子量和质量，如下所示， 双链 DNA 是从切萨皮克湾 Verio 浮游生物中提取的优势核酸类型。观看本视频后，您应该对如何使用羟基磷灰石色谱法从混合病毒组合中分离核酸有了很好的了解。

这包括制备羟基磷灰石柱和核酸，使用不同浓度的磷酸盐缓冲液分离和幻觉核酸和脱盐，以及分离后浓缩核酸。