Name: 分离单链DNA，双链DNA和RNA病毒使用羟基磷灰石色谱从环境社区 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 46 s
Description: 学习使用羟基磷灰石色谱法从环境病毒群落中分离单链DNA、双链DNA和RNA。该方法可实现高效分离，交叉污染低于9%，有助于研究病毒多样性和功能潜力。

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本研究由美国能源部科学办公室（BER）资助，合作研究协议编号为 De-FC02-02ER63453，以及美国国家科学基金会微生物基因组测序计划（资助编号 0626826 和 0731916）。我们感谢 John Glass 提供的技术专长和建议，以及 K. Eric Wommack 在环境样品采集方面的协助。

1. 溶液的配制
在进行羟基磷灰石柱层析之前，必须配制磷酸盐缓冲液，并对羟基磷灰石进行充分水化处理。
<ol>
<li>1 M 磷酸盐溶液，pH 6.8：在1 L烧瓶中，将119.98 g一水合磷酸二氢钠溶于1 L无菌、经DEPC处理的H₂O中2O. 在1L容量瓶中，将141.96 g磷酸氢二钠溶于1L无菌DEPC处理的H₂O中，配制1M磷酸氢二钠溶液。2O. 按1:1比例混合单体和二聚体溶液。将烧瓶置于搅拌器上，使用磁力搅拌子进行混合。通过添加氢氧化钠（提高pH）或磷酸（降低pH）将pH调节至6.8。</li>
<li> 0.12 M 磷酸盐缓冲液：在500 ml烧瓶中，加入30 ml 1 M 磷酸盐溶液（pH 6.8）、2.5 ml 10% 十二烷基硫酸钠（SDS）和5 ml 0.5 M EDTA。加入无菌的DEPC处理水至225 ml。调节pH至6.8。再用无菌的DEPC处理水定容至250 ml。高压灭菌。</li> 
<li>0.18 M 磷酸盐缓冲液：在500 ml 锥形瓶中，加入45 ml 1 M 磷酸盐溶液（pH 6.8）、2.5 ml 10% 十二烷基硫酸钠（SDS）和5 ml 0.5 M EDTA。加入无菌的、经DEPC处理的H₂O定容至500 ml。2O 至 225 ml。调节 pH 至 6.8。加入无菌的 DEPC 处理过的 H2O 至 250 ml。高压灭菌。</li> 
<li> 0.20 M 磷酸盐缓冲液：在500 ml 锥形瓶中，加入50 ml 1 M 磷酸盐溶液（pH 6.8）、2.5 ml 10% 十二烷基硫酸钠（SDS）和5 ml 0.5 M EDTA。加入无菌的、经DEPC处理的H₂O定容至500 ml。2加水定容至225 ml，调节pH至6.8。加入无菌的DEPC处理过的H2O 至 250 ml。高压灭菌。</li> 
<li> 0.40 M 磷酸盐缓冲液：在500 ml烧瓶中，加入100 ml 1 M 磷酸盐溶液（pH 6.8）、2.5 ml 10% 十二烷基硫酸钠（SDS）和5 ml 0.5 M EDTA。加入无菌的DEPC处理过的H₂O定容至500 ml。2O至225 ml。调节pH至6.8。加入无菌的DEPC处理过的H2O 至 250 ml。高压灭菌。</li> 
<li>“1.00 M 磷酸盐缓冲液”（该溶液中磷酸盐的实际浓度为 0.91 M）：在 500 ml 锥形瓶中，加入 30 ml 1 M 磷酸盐溶液（pH 6.8）、2.5 ml 10% 十二烷基硫酸钠（SDS）和 5 ml 0.5 M EDTA。加入无菌的 DEPC 处理水至终体积为 225 ml。调节 pH 至 6.8。加入无菌的 DEPC 处理水2O 至 250 ml。高压灭菌。</li> 
<li>羟基磷灰石水化：称取1 g羟基磷灰石，加入50 ml离心管中。加入6 ml 0.12 M磷酸盐缓冲液至羟基磷灰石中，颠倒混匀。使用前将温度升至 60°C 并充分混匀。长期储存于 4°C.</li>
<li>使用前，将所有磷酸盐缓冲液和水合羟基磷灰石平衡至 60°C.</li> 
</ol>
2. Econo-Column 的制备
<ol>
<li>关闭活塞。用去离子水反复冲洗层析柱数次。2通过反复倒置柱子并倾倒来完成。</li>
<li> 从 Econo 柱上取下旋塞，并对柱体进行高压灭菌以实现灭菌。</li>
<li> 更换并关闭活塞。向无菌Econo柱中加入1 ml Sigmacote，润湿所有玻璃表面。打开活塞，倾倒去除。</li>
<li> 将色谱柱连接至循环水浴，并将温度设定为 60°C为尽量减少柱体的热量散失，建议使用铝箔或泡沫管绝缘材料等隔热剂对柱体进行包裹。</li> 
<li> 用无菌、无RNase的H冲洗Econo柱两次2然后用无菌、无RN酶的0.12 M磷酸盐缓冲液洗涤两次。</li>
</ol>
3. 羟基磷灰石层析
<ol>
<li> 确保旋塞处于关闭状态，使用无菌的 2ml 血清移液管将 2ml 预先配制并重悬的羟基磷灰石缓慢加入 Econo 层析柱底部。</li>
<li> 让羟基磷灰石在重力作用下自然沉降 30 分钟。</li>
<li> 排出层析柱中的缓冲液并关闭旋塞。将核酸与 0.12M 磷酸盐缓冲液混合至终体积为 500 μl，并在加热块或水浴中 60°C 孵育 10 分钟。</li>
<li> 使用 2ml 血清移液管将用 0.12M 磷酸盐缓冲液配制的核酸快速加至羟基磷灰石上，注意不要扰动柱床。</li>
<li> 让核酸与羟基磷灰石结合 30 分钟。</li>
<li> 在层析柱下方放置一个 15ml 离心管，打开旋塞，收集含有单链 DNA 的初始流出液，然后关闭旋塞。</li>
<li> 向羟基磷灰石中加入 6ml 0.12M 磷酸盐缓冲液，注意不要扰动柱床，打开旋塞，从上一步的 15ml 管中收集单链 DNA，然后关闭旋塞。</li>
<li> 向收集的管中加入 1 体积的酚:氯仿:异戊醇（25:25:1 v/v/v）溶液，剧烈混匀后在 3500 × g 离心 15 分钟。将含有单链 DNA 的上清液转移至新的 15ml 离心管中。</li>
<li> 使用 6ml 0.20M 磷酸盐缓冲液重复步骤 3.76 和 3.87，以从柱中洗脱并纯化 RNA，注意使用新的 15ml 离心管进行收集。</li>
<li> 使用 6ml 0.40M 磷酸盐缓冲液重复步骤 3.76 和 3.87，以从柱中洗脱并纯化双链 DNA，注意使用新的 15ml 离心管进行收集。</li>
<li> 使用 6ml 1.00M 磷酸盐缓冲液重复步骤 3.76 和 3.87，以彻底洗脱柱中残留的任何双链 DNA，注意使用新的 15ml 离心管进行收集。</li>
</ol>
4. 核酸样品脱盐
<ol>
<li>将4-5 ml样品转移至配备30,000分子量截留超滤膜（Ultracel膜）的Amicon Ultra-4离心过滤装置中。</li>
<li>在固定角转子中以6,000 × g、30°C离心5分钟（或直至达到浓缩体积），将样品浓缩至< 500 μl。弃去滤过液。</li>
<li>将剩余样品加入Amicon Ultra-4离心过滤装置中，并用无RNase的1× TE缓冲液补加体积至4-5 ml。</li>
<li>在固定角转子中以6,000 × g、30°C离心5分钟（或直至达到浓缩体积），将样品浓缩至< 500 μl。弃去滤过液。</li>
<li>向Amicon Ultra-4离心过滤装置中加入4-5 ml无RNase的1× TE缓冲液。在固定角转子中以6,000 × g、30°C离心5分钟（或直至达到浓缩体积），将样品浓缩至< 500 μl。弃去滤过液。</li>
<li>重复步骤5共额外5次，以彻底去除核酸样品中的盐分。</li>
<li>将剩余样品转移至无菌的1.7 ml离心管中。加入1/10体积的3 M醋酸钠（pH 7.0）、两倍体积的100%乙醇以及1 μl Glycoblue。充分涡旋混匀。</li>
<li>在28,000 × g、4°C条件下离心60分钟。小心倾去上清液，避免扰动沉淀。加入300 μl 70%乙醇，在28,000 × g、室温下离心10分钟。倾去乙醇，干燥后将各组分重悬于适量体积的无RNase TE缓冲液中。</li>
</ol>
5. 代表性结果：
图1总结了利用羟基磷灰石层析从混合病毒群中分离单链DNA（ssDNA）、双链DNA（dsDNA）和RNA核酸的方法。该方法利用核酸中带负电荷的磷酸骨架与羟基磷灰石中带正电荷的Ca2+离子之间的电荷相互作用，通过逐步提高磷酸盐缓冲液浓度，可有效分离不同类型的核酸（ssDNA、dsDNA和RNA）12。
羟基磷灰石分级分离 体外 已知的单链DNA（M13mp18）、双链DNA（lambda）以及RNA（MS2和phi6）病毒基因组组成的“群落”如图2所示。这些核酸以相等浓度混合后上样至羟基磷灰石柱，并采用浓度递增的磷酸盐缓冲液进行洗脱。每种核酸亚型均独立洗脱，相邻组分间的残留转移少于9%。
该技术应用于从切萨皮克湾采集的病毒群落中分离的核酸的示例如下所示 图3. 将从纯化病毒中提取的总核酸产量上样至羟基磷灰石柱。单链DNA（ssDNA）、RNA和双链DNA（dsDNA）的基因组物质分别用0.12 M、0.20 M和0.40 M/1.00 M浓度的磷酸盐缓冲液独立洗脱。双链DNA在0.40 M和1.00 M磷酸盐浓度下被洗脱，在本例中其含量相较于单链DNA和RNA基因型在病毒群落中占主导地位。该结果与海洋及河口环境中病毒群落组成的预期一致，此类环境中可回收的核酸大部分为双链DNA。 13.
<img src="/files/ftp_upload/3146/3146fig1.jpg" alt="通过羟基磷灰石色谱法分离核酸。DNA、RNA在60°C下结合，使用缓冲液梯度洗脱。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 羟基磷灰石色谱法分离核酸的流程示意图。将单链DNA、双链DNA和RNA的混合物溶于0.12 M磷酸盐缓冲液中，加热至60°C，然后上样至羟基磷灰石柱，柱温通过循环水浴维持在恒定的60°C。通过逐步增加含磷酸盐缓冲液的浓度，将核酸（单链DNA、RNA和双链DNA）从羟基磷灰石上洗脱下来。该图已获美国微生物学会许可转载，最初发表于Andrews-Pfannkoch等（2010）12。
<img src="/files/ftp_upload/3146/3146fig2.jpg" alt="凝胶电泳结果；DNA条带分离；泳道已标记；显示分子量标记物。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 图2. 使用羟基磷灰石层析分离已知病毒核酸。将等浓度的M13mp18单链DNA、MS2单链RNA、phi6双链RNA和lambda双链DNA（分别为第2–5泳道）混合后上样至羟基磷灰石柱（第6泳道）。单链DNA（M13mp18）、RNA（MS2/phi6）和双链DNA（lambda）分别用0.12 M（第8泳道）、0.18 M（第9泳道）和0.40 M/1.00 M（第10泳道）进行洗脱。使用1 kb DNA ladder（第1和第7泳道）确认基因组大小。该图已获美国微生物学会许可转载，最初发表于Andrews-Pfannkoch等（2010）12。
<img src="/files/ftp_upload/3146/3146fig3.jpg" alt="DNA电泳结果；泳道比较；分子量标记指示用于分子分析的片段大小。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 3"> 图3. 从切萨皮克湾某一微生物群落中分离出的病毒核酸。核酸经提取后上样至羟基磷灰石柱，分别使用0.12 M、0.20 M和0.40 M/1.00 M的磷酸盐缓冲液，依次洗脱出ssDNA（泳道0.12M）、RNA（泳道0.20M）和dsDNA（泳道0.40M/1.0M）。使用Hi Mass DNA Ladder（泳道L1）和1kb Ladder（泳道L2）对核酸的大致分子量和质量进行直观确认。本图已获美国微生物学会许可转载，最初发表于Andrews-Pfannkoch等（2010）12。

<ol><li>Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prokaryotes%3A+The+Unseen+Majority%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Prokaryotes: The Unseen Majority.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 6578-65 (1998).</li>
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<li>Weinbauer, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophages%3A+Evolution+of+the+Majority%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Bacteriophages: Evolution of the Majority.</a> FEMS Microbiol Rev. 28, 127-127 (2004).</li>
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<li>Culley, A. I., Lang, A. S., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+Analysis+of+Coastal+RNA+Virus+Communities%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Metagenomic Analysis of Coastal RNA Virus Communities.</a> Science. 312, 1795-1795 (2006).</li>
<li>Bernardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromotography+of+Nucleic+Acids+on+Hydroxyapatite%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chromotography of Nucleic Acids on Hydroxyapatite.</a> Nature. 209, 779-779 (1965).</li>
<li>Andrews-Pfannkoch, C., Fadrosh, D. W., Thorpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyapatite-Mediated+Separation+of+Double-Stranded+DNA%2C+Single-Stranded+DNA+and+RNA+Genomes+from+Natural+Viral+Assemblages%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Hydroxyapatite-Mediated Separation of Double-Stranded DNA, Single-Stranded DNA and RNA Genomes from Natural Viral Assemblages.</a> Applied and environmental microbiology. 76, 5039-5039 (2010).</li>
<li>Wommack, K. E., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virioplankton%3A+Viruses+in+Aquatic+Ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 64, 69-69 (2000).</li>
</ol>

未声明利益冲突。

本文介绍的羟基磷灰石色谱方法是一种高效且稳健的技术，适用于在研究群落的总核酸组成时，从混合病毒群组中分离核酸。通常情况下，单链DNA（ssDNA）、RNA和双链DNA（dsDNA）将分别在磷酸盐缓冲液浓度高于约˜ 0 M、0 M和0.40 M时从色谱柱中洗脱出来。然而，每批羟基磷灰石的组成和洗脱特性可能略有差异，因此使用已知的核酸（例如来自可培养病毒制备物）对每批材料进行测试至关重要。这将使操作者能够确定洗脱目标核酸所需的含磷酸盐缓冲液的具体浓度。
该技术的一个限制因素是羟基磷灰石中可用于结合核酸磷酸骨架的可用 Ca2+ 离子数量。柱中羟基磷灰石的载样量可根据水夹套柱的尺寸和所用羟基磷灰石的量进行放大或缩小，洗脱缓冲液体积也可相应调整，以适应极少量或极大量的输入核酸，但最终受限于水夹套柱的尺寸。
此外，一种将核酸、羟基磷灰石和含磷酸盐缓冲液在离心管中混合，然后低速离心的批量处理方法，也可用于分离目标核酸。该策略在某些情况下可能具有优势，但其可靠性不如色谱法，后者更为准确，并能实现更好的核...

<table><tbody><tr><td>经济型层析柱</td><td>Bio-Rad</td><td>737-0717</td><td>0.7cm 内径，每包/2 根</td></tr><tr><td>羟基磷灰石</td><td>Bio-Rad</td><td>130-0520</td><td>DNA 级 Bio-Gel HTP 凝胶，100g/td&amp;gt;</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>VWR international</td><td>VW1497-01</td><td>一水合物，晶体，500g</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>VWR international</td><td>VW1496-01</td><td>无水，粉末，500g</td></tr><tr><td>DEPC 处理水</td><td>Invitrogen</td><td>AM9922</td><td>1L</td></tr><tr><td>10% SDS 溶液</td><td>Invitrogen</td><td>24730-020</td><td>超纯级，1L</td></tr><tr><td>0.5M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9262</td><td>pH 8.0，1L</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-25ML</td><td></td></tr><tr><td>2ml 血清移液管</td><td>VWR international</td><td>89130-884</td><td>聚苯乙烯，无菌</td></tr><tr><td>BD Falcon 离心管</td><td>VWR international</td><td>21008-936</td><td>15ml，无菌</td></tr><tr><td>苯酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1 v/v/v)</td><td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td>超纯级，100ml</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 离心浓缩装置</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC803024</td><td>Ultracel-30 膜</td></tr><tr><td>20X TE 缓冲液，RNase free</td><td>Invitrogen</td><td>T11493</td><td>100ml</td></tr><tr><td>蓝色糖原（Glycoblue）</td><td>Invitrogen</td><td>AM9516</td><td>15mg/ml</td></tr></tbody></table>

利用羟基磷灰石色谱法从环境病毒群落中分离单链dna、双链dna和rna

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

病毒，尤其是噬菌体（phages），是地球上数量最多的生物实体1,2。病毒可调节宿主细胞的丰度和多样性，参与营养物质的循环，改变宿主细胞的表型，并通过基因的水平转移影响宿主细胞和病毒群落的进化3。大量研究已揭示了病毒在多种自然环境中惊人的遗传多样性及其功能潜力。
宏基因组学技术已被用于研究包含单链DNA（ssDNA）、双链DNA（dsDNA）和RNA基因型的复杂病毒群落的分类多样性及其功能潜力4-9。目前用于研究环境样本中含DNA或含RNA病毒的文库构建方案，通常需要进行初始的核酸酶处理，以去除非目标模板10。然而，要全面理解病毒群落的整体基因组成及其多样性，必须掌握所有成员的信息，而不论其基因组组成如何。对纯化的核酸亚型进行分级分离，为研究病毒群落提供了一种有效的方法，同时避免了部分群落遗传特征的丢失。
自20世纪60年代以来，羟基磷灰石（一种结晶态的磷酸钙）已被用于核酸、蛋白质及微生物的分离11。通过利用羟基磷灰石中带正电荷的Ca2+离子与核酸亚型中带负电荷的磷酸骨架之间的电荷相互作用，可实现不同核酸亚型的独立洗脱。我们近期应用该策略，在DNA测序前独立分离含有单链DNA（ssDNA）、双链DNA（dsDNA）和RNA病毒的基因组12。本文中，我们介绍一种利用羟基磷灰石层析法从混合病毒群落中分离并回收ssDNA、dsDNA和RNA病毒核酸的方法。

我们描述了一种从环境病毒群落中有效分离单链DNA、双链DNA和RNA分子的方法。该方法利用含磷酸盐缓冲液浓度递增的羟基磷灰石色谱对核酸进行分级分离。此方法可实现从环境样品中分离出所有类型的病毒核酸。

利用羟基磷灰石色谱法从环境病毒群落中分离单链DNA、双链DNA和RNA

病毒，尤其是噬菌体（phages），是地球上数量最多的生物实体1,2。病毒能够调节宿主细胞的丰度和多样性，……

本视频演示了一种根据核酸组成分离混合病毒群落的方法。该方法可用于研究复杂病毒群落的分类多样性和功能潜力。此处采用羟基磷灰石（一种结晶态磷酸钙）进行核酸分离。首先，装填羟基磷灰石柱并进行平衡，然后将纯化的病毒核酸上样至柱中。羟基磷灰石中的带正电钙离子与核酸亚型带负电的磷酸骨架之间的电荷相互作用使核酸结合在柱上。接着，用不同浓度的磷酸盐缓冲液依次洗脱单链DNA、RNA以及双链DNA。所得核酸随后进行脱盐和浓缩，以备通过DNA测序、琼脂糖凝胶电泳进行可视化、定量和鉴定。琼脂糖凝胶电泳结果证实，不同核酸组分可被有效分离，交叉污染低于9%。因此，该方法能够评估病毒群落的多样性和功能潜力。大家好，我叫Doug Fro，是Shannon Williamson博士在j Craig Venture研究所实验室的一名研究助理。今天我将向大家演示一种从环境病毒群落中分离单链DNA、双链DNA和RNA的实验步骤。该方法相较于现有方法具有优势，例如针对 DNA 或 RNA 的细胞核处理方法。羟基磷灰石色谱法能够捕获完整的病毒群落。该方法使我们能够回答病毒生态学领域的多个问题。例如，病毒群落的全部基因组成或多样性如何？当我们希望在不牺牲部分遗传特征的前提下，研究切萨皮克湾整个里约浮游生物群落时，首次想到了这种方法。本实验所需的溶液应按照随附书面方案中的说明提前配制，包括 0.12 摩尔磷酸盐缓冲液、0.20 摩尔磷酸盐缓冲液、0.40 摩尔磷酸盐缓冲液以及 1 摩尔磷酸盐溶液。所有试剂均需调节至 pH 6.8，并在实验当天使用水合羟基磷灰石；将磷酸盐缓冲液和水合羟基磷灰石置于 60 摄氏度水浴中进行平衡。开始此操作前，先准备用于分离病毒核酸的 Econo 柱。在 Econo 柱末端连接一个旋塞，并确保其处于关闭状态。使用移液器向柱中加入去离子水，然后盖上柱子顶部的盖子，反复倒置柱子以冲洗。倒掉水，并重复此清洗步骤数次。接下来，从经济柱上取下旋塞阀，并对其进行高压灭菌以达到灭菌目的。旋塞阀不能进行高压灭菌，因为高温会导致其熔化。用去离子水冲洗旋塞阀，再用70%乙醇冲洗一次，然后在高压灭菌后使其自然晾干。更换旋塞阀并将其关闭。接下来，在通风橱中操作，向柱子中加入一毫升 Sigma 涂层溶液，并通过如图所示的滚动倒置方式使溶液均匀涂布柱体玻璃表面。使用 Sigma 涂层可最大限度减少核酸粘附于玻璃表面。在分离过程中，盐玻璃表面已进行涂层处理。打开活塞，将溶液倾入锥形管中。接着，使用两个夹子将层析柱固定在铁架台上，以连接循环水浴。将循环水浴的硅胶管连接至层析柱，使水流方向由下至上。将温度设置为 60 摄氏度并启动循环。在实际操作中，色谱柱和管路通常会用隔热材料包裹，例如铝箔或泡沫管材隔热层。为减少热量散失，但本步骤在此未予展示。为了更清楚地观察该操作步骤，关闭旋塞。使用移液器加入 10 毫升无菌无 RNA 酶的水。打开旋塞，使水排尽。然后按照第二次洗涤步骤再次洗涤。用10毫升无菌无RNAs的0.12摩尔磷酸缓冲液清洗两次，每次洗涤之间倾去液体。此时柱子已准备好进行羟基磷灰石层析。确保 econ 柱的旋塞阀处于关闭状态。然后使用无菌的 2 毫升血清移液管，缓慢将 2 毫升制备好的重悬再水化羟基磷灰石加入到柱底部。重新盖上柱帽。让羟基磷灰石在重力作用下沉淀30分钟。该方法需要细致操作。羟基磷灰石柱的流速为每分钟0.25至0.5毫升。因此，密切观察层析柱以防止其干涸非常重要。30 分钟后，打开活塞，将缓冲液排入废液容器中。关闭活塞，并弃去流出液。将核酸与0.12摩尔磷酸盐缓冲液混合，终体积为500微升，在60摄氏度孵育10分钟。此步骤可使核酸达到柱子的温度，并通过消除可能存在的任何二级结构，提高不同核酸种类的分离效果。使用2毫升血清学移液管，迅速将核酸溶液加到羟基磷灰石上，注意不要扰动柱体。当全部500微升液体流经柱子后，可在柱子顶部加入少量0.12摩尔磷酸盐缓冲液，以防止柱子干燥。让核酸与羟基磷灰石结合30分钟。结合孵育结束后，在柱子下方放置一个15毫升锥形管。然后打开旋塞，收集最初的500微升流出液，其中含有单链DNA。当收集到500微升后，关闭旋塞。接着，向羟基磷灰石中加入6毫升0.12摩尔的磷酸盐缓冲液，注意不要扰动柱体。然后打开活塞，继续将含有单链DNA的流穿液收集到上一步使用的同一个15毫升离心管中。当收集量达到约6毫升时，关闭活塞。向离心管中加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇溶液，剧烈涡旋混匀，然后在3,500 × g条件下离心15分钟。离心后，离心管中将出现两层液体。将含有单链 DNA 的上层清液转移至新的 15 毫升离心管中，并将样品在室温下保存，以从层析柱中洗脱并纯化 RNA，加入 6 毫升 0.20 摩尔磷酸缓冲液，并在使用新的 15 毫升离心管前收集穿流液。随后进行苯酚-氯仿抽提。对于单链DNA样品，使用6毫升0.40摩尔的磷酸盐缓冲液重复此过程，以从柱子中洗脱并纯化双链DNA。最后，为去除柱子中残留的双链DNA，再重复此过程一次。此次使用6毫升1.00摩尔的磷酸盐缓冲液对核酸样品进行脱盐。将每个样品的4至5毫升转移至配备30,000分子量截断超滤膜的Amicon Ultra-4离心过滤装置中，在30摄氏度下，使用固定角转子以6,000 ×g离心约5分钟，将样品浓缩至少于500微升。弃去滤过液后，将剩余样品全部加入滤膜中。用无RNAs的1×TE缓冲液将体积调至四到五毫升。然后再次离心，直至获得浓缩体积。离心约五分钟后，向滤膜中加入四到五毫升无RNAs的1×TE缓冲液并进行浓缩。再次重复上述洗涤步骤，共进行五次，以彻底去除核酸样品中的盐分。待样品完全浓缩并去盐后，将剩余的核酸样品转移至无菌的1.7毫升微量离心管中。通过加入十分之一体积的醋酸钠、两倍体积的100%乙醇以及1微升的GlycoBlue，混匀后充分涡旋震荡，随后离心沉淀核酸。28,000 ×g，4°C 离心 60 分钟。注意勿扰动沉淀。加入300微升70%乙醇，在室温下以28,000 ×g离心10分钟，切勿让样品完全干燥，然后将各组分重悬于适当体积的无RNA酶的TE缓冲液中。将等浓度的病毒核酸M13 MP18单链DNA、MS2单链RNA、fI6双链RNA和λ双链DNA混合，随后通过羟基磷灰石色谱法进行分离，如本视频所示。将等浓度的M13 MP18单链DNA、MS2单链RNA、fI6双链RNA和λ双链DNA混合（如第6泳道所示），并上样至羟基磷灰石柱，如图所示。使用浓度分别为 0.12 摩尔、0.18 摩尔、0.40 摩尔和 1.00 摩尔的磷酸盐缓冲液，从羟基磷灰石柱中分别洗脱单链 DNA-RNA 和双链 DNA。采用 1 KB DNA 标准分子量标记物来确认基因组大小。这些结果表明，该方法能够成功分离单链 DNA、双链 DNA 和 RNA，且各组分之间的交叉污染低于 9%。该方法还被用于分离切萨皮克湾病毒群落中提取的核酸，如图所示。单链 DNA-RNA 和双链 DNA 分别使用 0.12 摩尔、0.20 摩尔、0.40 摩尔或 1.00 摩尔的磷酸盐缓冲液浓度进行洗脱。第一泳道使用高分子量 DNA 标准 Marker，第二泳道使用 1 KB 标准 Marker，以直观确认核酸的近似分子量和大小，如图所示。从切萨皮克湾浮游病毒中提取的主要核酸类型为双链 DNA。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用羟基磷灰石色谱法从混合病毒群落中分离核酸。这包括羟基磷灰石柱和核酸的制备、利用不同浓度的磷酸盐缓冲液对核酸进行分离与洗脱、脱盐，以及分离后对核酸进行浓缩。

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