Name: 代谢物的浓度从低密度浮游社区的环境代谢，利用核磁共振光谱 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: 了解利用核磁共振光谱技术从低密度浮游微生物群落中提取和浓缩代谢物的完整实验方法。该方法通过过滤、冷冻干燥和萃取步骤，实现环境代谢组学研究中的代谢物分析。

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本研究部分得到了日本文部科学省挑战性探索研究助成金（J.K.）以及科学研究费助成金（A类）（J.K. 和 S.M.）的资助。理化学研究所FPR博士后 fellowship（R.C.E.）提供了额外支持。作者对千叶惠介博士、关山泰世博士和冈本真美博士在核磁共振及统计分析方面的技术支持表示衷心感谢。

1. 滤材准备以去除可提取物
<ol>
 <li>使用25 mm直径 0.22 μm 孔径为 Durapore PVDF 亲水性滤膜（Millipore）。使用镊子将滤膜置于洁净的 500 ml Pyrex 烧杯中。用蒸馏水预冲洗三次，每次冲洗时充分振荡，以防止滤膜相互粘连。加入 300 ml Milli-Q（Millipore）或同等质量的高纯水。进行高压灭菌，以促进彻底去除滤膜中的可溶出物。 </li>
 <li>倒掉Milli-Q水，再用Milli-Q水将滤膜彻底冲洗三次。用镊子将单个滤膜置于洁净干燥的表面（如铝箔）上，并在适当温度下干燥（例如 37 °C）或空气干燥。滤膜现已可直接使用。</li>
</ol>
2. 样品材料的过滤
<ol>
 <li>为演示本方案，使用 Millipore 不锈钢三联过滤装置，配备 25 mm 微分析滤柱、玻璃支撑架及机械泵。采用无菌技术，将单个 25 mm 滤膜置于滤柱底座上，安装滤柱并夹紧。</li>
 <li>向滤柱中加入 15 ml 样品，打开过滤装置上的截止阀，启动泵。在轻柔压力下过滤，以尽量减少细胞破裂（<5 kPa）。其他类型的泵（如手动泵或蠕动泵）也可适配于本方案。对于密度较低的样品，可能需要连续添加水；在加水间隔期间，切勿让滤膜长时间干燥。</li>
 <li>对于海水样品，在完成样品过滤后，可进行可选的去离子水冲洗步骤，以减少样品及滤膜上残留的顺磁性离子。此步骤可能有助于更精确地调节波谱仪磁体。只需在过滤结束时，轻轻加入少量水并使其通过已收集的样品进行过滤即可。</li>
 <li>过滤完成后，关闭泵，并保持阀门开启，使滤膜下方仍维持负压状态。取下夹具和滤柱。</li>
 <li>用一只手使用洁净镊子夹住滤膜，将其对折，但不要压出折痕。另一只手用无菌 2 ml 微离心管的管口边缘压住滤膜。松开镊子后，重新用镊子夹住滤膜两侧边缘，并以与折痕成 45° 角的方向再次夹紧。</li>
 <li>将滤膜放入 2 ml 管中，松开镊子使其展开，样品面朝内。可按此方式将最多两张滤膜放入同一无菌 2 ml 微离心管中。若使用两张滤膜，应尽量减少重叠。立即冷冻（至少 -30 °C）。</li>
</ol>
3. 水溶性代谢物的提取
<ol>
 <li>将样品冷冻干燥过夜或至少10小时。</li>
 <li>冻干后，向每根试管中加入一个不锈钢研磨珠（Tokken）。加入750 μl 标准化的磷酸钾核磁共振缓冲液（重水溶液中，2H > 90%），内含2,2-二甲基-2-硅代戊烷-5-磺酸钠（DSS）标准品（KPi；38.3 mM KH2PO4，61.7 mM K2HPO4，DSS 0.1 mM，pH 7.0，90% D2O）2。</li>
 <li>将样品置于水浴超声仪（Bioruptor，Diagenode）中，在4 °C条件下超声处理5分钟，以从滤膜上解离细胞物质。用洁净镊子取出滤膜。</li>
 <li>使用研磨破碎仪（1600 rpm）破碎细胞，持续5分钟。</li>
 <li>在台式摇床（Eppendorf）上，65 °C、1400 rpm条件下振荡孵育15分钟。</li>
 <li>用洁净镊子取出金属研磨珠，并在13,000 g条件下离心5分钟。</li>
 <li>直接吸取上清液至核磁共振管中，用于核磁共振波谱分析。</li>
</ol>
4. 核磁共振波谱与数据分析
<ol>
 <li>将样品装入核磁共振波谱仪中（此处使用配备三轴梯度TXI探头的Bruker DRX-500波谱仪，由运行XWIN-NMR软件的计算机控制）。</li>
 <li>通过XWIN-NMR界面，采用适当的已发表方法2,15获取一维1H NMR谱图。在本研究中，1H NMR谱图在298 K条件下于500.03 MHz的DRX-500波谱仪上记录。采用Watergate脉冲序列抑制残留水信号，重复时间为1.2 s。每张谱图采集128次瞬态信号，获得32,000个数据点。</li>
 <li>将NMR数据目录转移至安装有NMRPipe软件16的PC。对原始数据进行处理，并以DSS作为0 ppm参考标准，然后手动调整谱图相位。使用rNMR、Automics软件，或ECOMICS网站（<a href="https://database.riken.jp/ecomics/">https://database.riken.jp/ecomics/</a>）提供的公开FT2B程序包，通过积分或“分箱”方法将谱图数据数字化为一组离散值3,17。在本示例中，使用ECOMICS在0.5至10.5 ppm范围内以0.032 ppm为积分区间进行积分，并将数据归一化至DSS或总信号强度。输出数据可用于后续统计分析，例如使用免费软件包R18进行主成分分析（PCA）。</li>
</ol>
5. 代表性结果
使用上述方法获得的1H NMR 谱图示例如图1所示。这些样品来自微宇宙实验中两个不同时间点，显示出由于藻类代谢活动引起的明显差异。第4天的谱图相较于第1天的样品在3-4 ppm范围内出现了大量显著的峰信号。这些峰可归因于微宇宙中硅藻大量繁殖所产生的糖类物质。在另一项类似的实验中，通过比较天然浮游生物群落在人工海水与天然海水中生长的情况，可利用基于分段NMR谱图的主成分分析（PCA）得分图等统计方法来展示两种处理之间的明显代谢差异（图2），而载荷图则可用于识别影响数据分布特征的谱图中的关键峰。此类结果可与其他组学层面的数据进行比较，例如基因组指纹图谱方法所得数据（图3）。这些NMR峰可单独进行查询（例如通过BMRB数据库；<a href="http://www.bmrb.wisc.edu/">http://www.bmrb.wisc.edu/</a>）19，或对整个谱图进行统计分析（例如使用SpinAssign工具，网址：<a href="http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search">http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search</a>）2。在本示例中，不同处理之间的差异主要表现为天然浮游生物群落代谢物谱图中糖类区域（3.39 ppm至4.04 ppm）峰信号的丰度较高，同时利用SpinAssign初步鉴定出人工海水群落特有的若干峰为乳酸和甲酸。
<img src="/files/ftp_upload/3163/3163fig1.jpg" alt="显示4天内化学位移变化的核磁共振谱图；质子位移分析方法。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 采用本实验流程处理样品后获得的代表性1H NMR谱图。微型生态系统样品分别在硅藻大量繁殖前（第1天）和繁殖期间（第4天）采集。核磁共振实验在Bruker DRX-500上进行，信号以内部标准物峰高（DSS；0 ppm）归一化。
<img src="/files/ftp_upload/3163/3163fig2.jpg" alt="主成分分析图；PC1 与 PC2 数据分布；统计分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 对在天然（空心菱形）或人工（黑色圆点）海水中培养的微宇宙中自然来源的浮游微生物群落代谢组的分箱 NMR 谱图进行主成分分析（PCA）的得分图。散点图中可明显观察到代谢差异。通过该分析的载荷图可进一步识别体系中具有显著意义的特征峰；这些峰可根据需要进行进一步分析。
<img src="/files/ftp_upload/3163/3163fig3.jpg" alt="主成分分析图；真核生物与细菌数据比较；PC1 与 PC2 散点图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3. 结合核磁共振（NMR）与基因组数据的多组学分析示例。基于对与图 2相同样品的18S（左）和16S（右）rRNA基因进行变性梯度凝胶电泳所获得的群落组成，也显示出天然（空心菱形）与人工（黑色圆圈）海水微宇宙之间明显的微生物群落差异。代谢组与来自自然系统的基因组之间的这种对应关系，证明了该方法的实用性。

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<li>Sekiyama, Y., Chikayama, E., Kikuchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+polar+and+semipolar+plant+metabolites+throughout+extraction+processes+using+a+combined+solution-state+and+high-resolution+magic+angle+spinning+NMR+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Profiling polar and semipolar plant metabolites throughout extraction processes using a combined solution-state and high-resolution magic angle spinning NMR approach.</a> Anal. Chem. 82, 1643-1652 (2011).</li>
</ol>

未声明利益冲突。

本文所展示的过滤与代谢物提取方法，能够收集到足量的浮游微生物生物量，用于核磁共振（NMR）代谢组学分析。尽管此处仅展示了使用磷酸钾缓冲液（KPi）提取水溶性代谢物并结合一维1H NMR检测的方法，但也可采用其他提取溶剂和光谱分析手段。一个有效的示例是使用氘代甲醇作为中等极性溶剂，该方法已被证明可从成分复杂的样品中获得更高质量的NMR谱图，且对海洋样品中常见的顺磁性离子污染具有较低的敏感性15。在此类情况下，上述提取步骤所得的沉淀物应予以保留，以便进行后续的连续提取。我们先前的研究已证实，在此类孵育时间和温度条件下谱图具有良好的稳定性，并验证了直接水相提取法适用于NMR波谱分析15,20。然而，研究人员也可根据需要对提取步骤进行调整，例如在提取前增加变性步骤以灭活酶活性，或采用不同于本实验中简单冷冻细胞的快速淬灭方法。此外，尽管本文所述方法最适合用于观察不同处理组间代谢物的相对变化，但如有需要，也可在过滤前对滤膜进行预称重，并在样品过滤及冷冻干燥后再次称重以获得干重数据，或利用过滤样品的体积来获取更具定量性的代谢物来源信息。
<p class="jove_conte...

<table><tbody><tr><td>0.22 &amp;mu;m 亲水性 Durapore PVDF 滤膜，25 mm</td><td>EMD Millipore</td><td>GVWP02500</td><td></td></tr><tr><td>微量分析滤器支架，25 mm，带烧结玻璃支撑</td><td>EMD Millipore</td><td>XX1002500</td><td></td></tr><tr><td>三通道不锈钢滤器装置，47 mm</td><td>EMD Millipore</td><td>XX2504735</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>和光纯药工业株式会社</td><td>169-04245</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>和光纯药工业株式会社</td><td>164-04295</td><td></td></tr><tr><td>氘代水，&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;H &amp;gt; 90%</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-4</td><td></td></tr><tr><td>DSS</td><td>Fluka</td><td>92754</td><td></td></tr><tr><td>Automill</td><td>Tokken</td><td>TK-AM4</td><td>包含不锈钢研磨器</td></tr><tr><td>Thermomixer comfort</td><td>Eppendorf</td><td>5355 000.011</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200</td><td></td></tr><tr><td>真空浓缩仪</td><td>EYELA</td><td>CVE-3100</td><td></td></tr><tr><td>NMR</td><td>Bruker Corporation</td><td>DRX-500 配备 5 mm-TXI 探头</td><td></td></tr><tr><td>谱图分箱工具</td><td>自主开发</td><td>FT2DB</td><td>&lt;a href=&quot;https://database.riken.jp/ecomics/">https://database.riken.jp/ecomics/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>代谢物注释工具与数据库</td><td>自主开发</td><td>SpinAssign</td><td>&lt;a href=&quot;http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search">http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

利用核磁共振波谱法对低密度浮游群落环境代谢组学样品中代谢物的浓缩方法

Concentration of Metabolites from Low-density Planktonic Communities for Environmental Metabolomics using Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

环境代谢组学是一个新兴领域，正在推动人们对生物体在生化水平上如何响应环境以及彼此之间相互作用的新认识1。核磁共振（NMR）波谱法是多种可用于此类研究的技术之一，其他技术包括气相色谱-质谱联用（GC-MS），在该领域具有广阔前景。NMR的优势在于适用于非靶向分析，能够提供结构信息，并且其谱图可通过近年来可用的单个代谢物谱图数据库，以定量和统计方式进行比对查询2,3。此外，NMR谱数据还可与其他组学层面的数据（如转录组学、基因组学）相结合，从而更全面地理解生物类群对彼此及环境的生理响应4,5,6。然而，NMR的灵敏度低于其他代谢组学技术，因此在应用于天然微生物系统时存在困难，因为在这些系统中，样本生物数量通常密度较低，代谢物浓度也远低于来自定义明确且易于提取的来源（如完整组织、生物体液或细胞培养物）中的代谢物。因此，迄今为止开展的少数直接针对环境微生物的代谢组学研究，仅限于基于培养或易于定义的高密度生态系统，例如宿主-共生体系统、构建的共培养体系，或可额外使用稳定同位素标记以增强NMR信号的肠道环境操控实验7,8,9,10,11,12。目前尚缺乏能够将环境代谢物富集至适合NMR检测浓度的方法。鉴于近期研究 increasingly 关注水生环境中生物体的环境代谢组学，而水体中大部分能量与物质流动均由浮游生物群落介导13,14，我们开发了一种通过过滤法对浮游微生物系统中的全群落代谢物进行富集和提取的方法。 commercially available 亲水性聚-1,1-二氟乙烯（PVDF）滤膜经过特殊处理以彻底去除可提取物，避免其在后续分析中成为污染物。经处理的滤膜用于过滤感兴趣的环境或实验样品。含有湿样品材料的滤膜经冷冻干燥后，使用标准化的磷酸钾提取缓冲液2直接提取水溶性代谢物，用于常规NMR波谱分析。采用这些方法获得的数据可进行统计分析以识别有意义的模式，或与其他组学层面数据整合，以全面理解群落和生态系统的功能。

本文介绍了一种从浮游微生物群落中提取代谢物的方法。通过将样品过滤至特制的滤膜上，实现整个群落的采样。经过冻干处理后，提取水溶性代谢物。该方法可将环境代谢组学应用于自然或实验性微生物群落的跨组学研究。

环境代谢组学是一个新兴领域，正在推动人们对生物体如何响应及与环境相互作用的新认识……

核磁共振波谱法在环境代谢组学研究中具有多种显著优势，但在此过程中相对不够灵敏。本文报道了一种适用于核磁共振的从整体系统中浓缩和提取全群落代谢物的过滤方法。该方法首先通过去除可提取物对用于样品采集的滤膜进行特殊预处理，从而实现这一目标。该实验方案的第二步是将样品（天然或实验性）过滤至滤膜上。第三步是使样品材料裂解并提取代谢物。最后一步是使用核磁共振波谱法分析样品，并根据需要整合数据。最终，通过代谢组学和转运组学方法，可以获得自然样品在环境梯度下或对实验干预响应的代谢变化结果。与现有方法（如离心法）相比，该技术的主要优势在于能够对整个微生物群落进行取样，并且适用于低密度样品的大体积采集。该方法有助于回答环境金属混合领域中的关键科学问题，例如微生物群落如何响应环境变化。本实验流程将由我实验室的 Stage 和 From 演示。使用镊子将滤膜放入洁净的500毫升Pyrex烧杯中，开始本实验方案。加入蒸馏水覆盖滤膜，轻轻旋转冲洗，以防止滤膜相互粘连。倒去水分，重复冲洗两次。最后一次冲洗后，向烧杯中加入 300 毫升 Milli Q 水，并对滤膜进行高压灭菌。滤膜高压灭菌后，倒去 Milli Q 水，并用 Milli Q 水按照之前的方法对滤膜进行三次冲洗。使用镊子将各个滤膜放置在清洁干燥的表面（如铝箔）上，并在适当温度下干燥。例如，在 37°C 下或室温晾干。干燥后的滤膜即可用于本实验方案的演示。采用无菌技术，使用配备 25 毫米微分析滤柱、玻璃支撑架和机械泵的密理博不锈钢三联过滤装置。将一个25毫米的滤膜置于滤柱底部。安装滤柱并用夹具将装置固定在一起。将此处从高营养微宇宙系统中获得的15毫升样品加入滤柱中。打开滤器歧管上的截止阀，并在低压下启动泵滤，以尽量减少细胞破碎。对于密度较低的样品，可能需要多次加水。注意在每次加水的间隔期间，避免滤膜长时间干燥。第二步，减少海洋样品中残留的顺磁性盐，可选择进行淡水冲洗。过滤完成后，关闭泵并保持阀门打开，使滤膜下方仍保持负压状态。用一只手取下夹子和滤柱。使用洁净的镊子夹住滤膜。用另一只手将滤膜对折，但不要压出折痕。用无菌的2毫升微量离心管管口压住滤膜，使其固定。将滤膜放入2毫升离心管中，并松开使其展开，确保样品面朝向管内。立即用液氮冷冻，以提取水溶性代谢物。首先将样品在冻干后于4℃下复溶过夜或至少10小时，然后向每根离心管中加入一颗不锈钢研磨珠。加入750微升标准化磷酸钾缓冲液和含DSS标准品的重水。将样品置于4摄氏度水浴超声仪中，超声处理5分钟，以去除滤膜上的细胞物质。使用洁净镊子取出滤膜。使用研磨破碎机以1600转/分钟的速度破碎细胞，持续5分钟。接着，在65摄氏度下孵育。在台式摇床中振荡15分钟。孵育结束后，用洁净的镊子移除金属研磨器。将样品在13,000 G条件下离心五分钟。离心后，吸取上清液并直接转移至核磁共振管中，用于核磁共振波谱分析。将样品放入核磁共振波谱仪中。使用配备有三轴梯度TXI探头、在298开尔文下运行的布鲁克DRX 500波谱仪进行样品检测。对磁体进行锁场、调谐和匀场。使用TopSpin界面及先前描述的方法获取一维质子核磁共振谱，或根据需要使用其他波谱仪界面软件。本实验中，采用Watergate脉冲序列抑制残余水信号，重复时间为1.2秒。在本示例中，每个样品采集128次瞬态信号。将 NMR 数据目录转移至已安装 NMR pipe 软件的个人计算机。处理原始数据，将 DSS 信号设为 0 PPM 参考标准，然后手动调整谱图的相位。通过电子商务网站提供的公开可用的 FT two B 软件包进行分段处理，以数字化谱图数据。也可使用其他软件工具，如 RNMR 或 Atomics 进行分段（bin）。数据可归一化至总信号或 DSS 信号，以显示样本间的相对信号变化。输出的数据现在可用于后续的统计分析，例如使用免费软件包 R 进行主成分分析（PCA）。以下是使用所述方法获得的质子核磁共振（NMR）谱图示例。这些谱图来自一个微宇宙实验的两个时间点，显示出由于藻类代谢活动引起的明显差异。第4天的谱图显示峰的数量显著增多，特别是在3至4:00 PM范围内，与第1天的样品相比尤为明显。这些峰可归因于微宇宙中硅藻水华所产生的糖类物质。在一项类似的实验中，利用Mr.Spectra弯曲处光谱数据生成的主成分分析（PCA）得分图，展示了前两个主成分，用于比较天然浮游生物群落在人工海水与天然海水中的生长情况。这种统计方法将多维数据简化为更易理解的二维形式，从而直观揭示底层数据点之间的结构关系。此处一个或两个轴更为相似，可明显观察到两种处理之间的代谢差异。本实验的数据被用于进行多组学分析。将核磁共振（NMR）与基因组数据相结合，基于18S和16S rRNA基因的变性梯度凝胶电泳分析微生物群落组成，结果也显示出天然海水与人工海水微宇宙系统之间存在显著不同的微生物群落模式。这种来自自然系统的代谢组与基因组之间的一致性，证明了该方法的实用性。在实施该实验流程时，重要的是需采用适当的实验技术，以尽量减少污染。请在完成本步骤后遵循后续操作。还可以采用其他方法，例如结合组学水平的构建分析，以回答更多问题，如微生物组如何与特定代谢物相关联。

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