利用核磁共振波谱法对低密度浮游群落环境代谢组学样品中代谢物的浓缩方法

核磁共振波谱法在环境代谢组学研究中具有多种显著优势，但在此过程中相对不够灵敏。本文报道了一种适用于核磁共振的从整体系统中浓缩和提取全群落代谢物的过滤方法。该方法首先通过去除可提取物对用于样品采集的滤膜进行特殊预处理，从而实现这一目标。

该实验方案的第二步是将样品（天然或实验性）过滤至滤膜上。第三步是使样品材料裂解并提取代谢物。最后一步是使用核磁共振波谱法分析样品，并根据需要整合数据。

最终，通过代谢组学和转运组学方法，可以获得自然样品在环境梯度下或对实验干预响应的代谢变化结果。与现有方法（如离心法）相比，该技术的主要优势在于能够对整个微生物群落进行取样，并且适用于低密度样品的大体积采集。该方法有助于回答环境金属混合领域中的关键科学问题，例如微生物群落如何响应环境变化。本实验流程将由我实验室的 Stage 和 From 演示。

使用镊子将滤膜放入洁净的500毫升Pyrex烧杯中，开始本实验方案。加入蒸馏水覆盖滤膜，轻轻旋转冲洗，以防止滤膜相互粘连。倒去水分，重复冲洗两次。

最后一次冲洗后，向烧杯中加入 300 毫升 Milli Q 水，并对滤膜进行高压灭菌。滤膜高压灭菌后，倒去 Milli Q 水，并用 Milli Q 水按照之前的方法对滤膜进行三次冲洗。

使用镊子将各个滤膜放置在清洁干燥的表面（如铝箔）上，并在适当温度下干燥。例如，在 37°C 下或室温晾干。干燥后的滤膜即可用于本实验方案的演示。采用无菌技术，使用配备 25 毫米微分析滤柱、玻璃支撑架和机械泵的密理博不锈钢三联过滤装置。

将一个25毫米的滤膜置于滤柱底部。安装滤柱并用夹具将装置固定在一起。将此处从高营养微宇宙系统中获得的15毫升样品加入滤柱中。

打开滤器歧管上的截止阀，并在低压下启动泵滤，以尽量减少细胞破碎。对于密度较低的样品，可能需要多次加水。注意在每次加水的间隔期间，避免滤膜长时间干燥。

第二步，减少海洋样品中残留的顺磁性盐，可选择进行淡水冲洗。过滤完成后，关闭泵并保持阀门打开，使滤膜下方仍保持负压状态。用一只手取下夹子和滤柱。

使用洁净的镊子夹住滤膜。用另一只手将滤膜对折，但不要压出折痕。用无菌的2毫升微量离心管管口压住滤膜，使其固定。

将滤膜放入2毫升离心管中，并松开使其展开，确保样品面朝向管内。立即用液氮冷冻，以提取水溶性代谢物。首先将样品在冻干后于4℃下复溶过夜或至少10小时，然后向每根离心管中加入一颗不锈钢研磨珠。

加入750微升标准化磷酸钾缓冲液和含DSS标准品的重水。将样品置于4摄氏度水浴超声仪中，超声处理5分钟，以去除滤膜上的细胞物质。使用洁净镊子取出滤膜。

使用研磨破碎机以1600转/分钟的速度破碎细胞，持续5分钟。接着，在65摄氏度下孵育。在台式摇床中振荡15分钟。

孵育结束后，用洁净的镊子移除金属研磨器。将样品在13,000 G条件下离心五分钟。离心后，吸取上清液并直接转移至核磁共振管中，用于核磁共振波谱分析。

将样品放入核磁共振波谱仪中。使用配备有三轴梯度TXI探头、在298开尔文下运行的布鲁克DRX 500波谱仪进行样品检测。对磁体进行锁场、调谐和匀场。

使用TopSpin界面及先前描述的方法获取一维质子核磁共振谱，或根据需要使用其他波谱仪界面软件。本实验中，采用Watergate脉冲序列抑制残余水信号，重复时间为1.2秒。在本示例中，每个样品采集128次瞬态信号。

将 NMR 数据目录转移至已安装 NMR pipe 软件的个人计算机。处理原始数据，将 DSS 信号设为 0 PPM 参考标准，然后手动调整谱图的相位。通过电子商务网站提供的公开可用的 FT two B 软件包进行分段处理，以数字化谱图数据。

也可使用其他软件工具，如 RNMR 或 Atomics 进行分段（bin）。数据可归一化至总信号或 DSS 信号，以显示样本间的相对信号变化。输出的数据现在可用于后续的统计分析，例如使用免费软件包 R 进行主成分分析（PCA）。

以下是使用所述方法获得的质子核磁共振（NMR）谱图示例。这些谱图来自一个微宇宙实验的两个时间点，显示出由于藻类代谢活动引起的明显差异。第4天的谱图显示峰的数量显著增多，特别是在3至4:00 PM范围内，与第1天的样品相比尤为明显。

这些峰可归因于微宇宙中硅藻水华所产生的糖类物质。在一项类似的实验中，利用Mr.Spectra弯曲处光谱数据生成的主成分分析（PCA）得分图，展示了前两个主成分，用于比较天然浮游生物群落在人工海水与天然海水中的生长情况。这种统计方法将多维数据简化为更易理解的二维形式，从而直观揭示底层数据点之间的结构关系。

此处一个或两个轴更为相似，可明显观察到两种处理之间的代谢差异。本实验的数据被用于进行多组学分析。

将核磁共振（NMR）与基因组数据相结合，基于18S和16S rRNA基因的变性梯度凝胶电泳分析微生物群落组成，结果也显示出天然海水与人工海水微宇宙系统之间存在显著不同的微生物群落模式。这种来自自然系统的代谢组与基因组之间的一致性，证明了该方法的实用性。在实施该实验流程时，重要的是需采用适当的实验技术，以尽量减少污染。请在完成本步骤后遵循后续操作。

还可以采用其他方法，例如结合组学水平的构建分析，以回答更多问题，如微生物组如何与特定代谢物相关联。