小鼠脊髓软膜下基因递送以评估基因表达

取一只麻醉小鼠，剃除其背部毛发，并对皮肤进行消毒。

切开皮肤，分离肌肉与椎骨，并使用钳子牵开肌肉。

钻入椎板以产生裂隙，随后去除骨碎片，暴露硬脊膜（即脊髓外层膜）。

使用针头制造硬膜切口，并刺破下方的软脑膜，以进入软膜下腔，直接接触脊髓组织。

取一支含有携带表达荧光蛋白基因的重组腺相关病毒悬浮液的递送针，将该悬浮液注入。

拔出针头，缝合肌肉和皮肤，并让小鼠恢复。

病毒与神经元和胶质细胞上的受体结合，并被内吞。

进入细胞核后，病毒会启动基因表达，以产生荧光蛋白。

现在可以利用软膜下基因递送模型评估脊髓中目标基因的表达情况。

首先对动物进行适当的手术麻醉，此处使用异氟烷。在继续操作前，需确认动物对足垫夹捏无反应。随后，用眼用软膏覆盖其眼睛。接着，使用电推剪剃除动物背部的毛发，并用2%氯己定清洁皮肤。

如果需要进行腰段软脊膜下注射，使用手术刀切开覆盖在T8至L1椎骨上方的皮肤。然后用剪刀剥离T10至T12脊椎的椎旁肌。使用小鼠脊柱夹具将动物固定在标准的立体定位框架上。接着，使用牙科钻头磨除T10至T12椎骨椎板两侧，直至出现裂纹。

然后，使用镊子移除碎裂的骨片，暴露腰段脊髓的背侧表面。此时硬脑膜已可见。用一支30号不锈钢针头在硬脑膜上做一个1至2毫米的切口。

必须小心切开硬脑膜，以避免损伤其下方的软脑膜。

现在，用镊子夹住切开的硬脑膜边缘，并将硬脑膜切口扩大至最多5毫米。使用玻璃毛细管夹持器，将34号穿透软脑膜的针头和36号注射针头分别安装到两个独立的XYZ操纵器的Z臂上。

接下来，使用连接PE-10或PE-20管路的50微升微量注射器吸取AAV9-UBI-GFP病毒。病毒加载完成后，将管路末端连接至注射针头。然后，在8至10倍放大倍率的手术解剖显微镜下观察，利用X轴臂将穿透软脑膜的针头插入软脑膜，深度达1毫米。保持穿刺针头与组织表面呈5至10度角。

打开软脑膜后，使用X轴臂将穿透软脑膜的针头从软脑膜下空间取出。利用解剖标志（如血管）标记穿透位点。移动第二个操作臂的X、Y和Z轴，将携带AAV9病毒的注射针尖对准已穿透软脑膜的位点。

然后，将注射针尖插入软膜下腔约0.5毫米后，使用Z轴臂将软脑膜向上抬升约0.3毫米，再使用X轴臂将针头继续水平推进至软膜下腔。推进针头，直至其进入深度约为2至3毫米的软膜下腔。

然后，使用50微升微量注射器将AAV9-UBI-GFP病毒注入软脑膜下腔。AAV9-UBI-GFP注射完成后，将注射针从软脑膜下腔退出。使用氟碳单丝缝合线和外科缝合夹关闭肌肉和皮肤。将动物置于加热垫上恢复意识，之后放入清洁的笼具中饲养。