小鼠脊髓中的软膜下基因递送以评估基因表达

取一只麻醉的老鼠，剃掉它的背部，并对皮肤进行消毒。

切开皮肤，将肌肉从椎骨上分离出来，然后使用夹子将其缩回。

入椎板以产生裂缝，然后去除骨碎片以暴露硬脑膜，即脊髓外膜。

使用针头创建一个硬脑膜开口并刺穿下面的软脑膜以进入软膜下空间以直接进入脊柱组织。

取含有携带荧光蛋白表达基因的重组腺相关病毒悬浮液的输送针并注射悬浮液。

拔出针头，缝合肌肉和皮肤，让小鼠恢复。

该病毒与神经元和神经胶质细胞上的受体结合并进行内吞。

一旦进入细胞核，病毒就会触发基因表达以产生荧光蛋白。

软膜下基因递送模型现已准备好评估脊髓中靶基因的表达。

首先对动物进行适当的麻醉以进行手术。这里使用异氟醚。在继续之前，请确保没有捏爪反应。然后用眼药膏遮住眼睛。接下来，用剪刀剃掉动物的背部，并用 2% 洗必泰清洁皮肤。

如果要进行腰椎软膜下注射，请用手术刀切开覆盖 T8 至 L1 椎骨的皮肤。然后用剪刀将椎旁肌从T10到T12椎骨上分离出来。使用小鼠脊柱夹将动物安装到标准立体定向框架中。接下来，使用牙钻剃除 T10 至 T12 椎骨椎板的两侧，直到出现裂缝。

然后，用镊子去除破裂的骨碎片，露出腰脊髓的背面。硬脑膜现在可见。使用 30 号不锈钢针在硬脑膜上做一个 1 到 2 毫米的切口。

小心地切开硬脑膜，以避免损伤下面的软脑膜。

现在，用镊子抓住切割的硬脑膜的边缘，并将硬脑膜开口延长多达 5 毫米。使用玻璃毛细管支架将 34 号软脑膜穿透针和 36 号注射针安装到两个独立 XYZ 机械手的 Z 臂上。

接下来，使用与PE-10或PE-20管连接的50微升微型注射器加载AAV9-UBI-GFP病毒。加载病毒后，将管子的末端连接到注射针头。接下来，在通过设置为 8 至 10 倍放大倍率的手术解剖镜观察时，使用 X 臂将软脑膜穿透针降低到软脑膜中，深度为 1 毫米。保持穿透针相对于组织表面的角度为 5 至 10 度。

打开软脑膜后，用X臂将软脑膜穿透针从软脑膜下空间取出。使用地标（例如血管）记录穿透部位。移动第二个机械手的 X、Y 和 Z 臂，将载有 AAV9 病毒的注射针头的尖端定位到软脑膜穿透部位。

然后，将注射针的尖端插入软脑膜下间隙约0.5毫米后，用Z臂将软脑膜抬起约0.3毫米，然后用X臂继续将针头水平推进到软脑膜下空间。推进针头，直到它进入约 2 至 3 毫米深度的软膜下空间。

然后，使用 50 微升微型注射器将 AAV9-UBI-GFP 病毒注射到软膜下空间。AAV9-UBI-GFP注射完成后，从软膜下空间取出注射针。使用氟单丝缝合线和手术夹闭合肌肉和皮肤。让动物在加热垫上恢复，然后再被关在干净的笼子里。