可视登革病毒通过的Alexa Fluor标签
2011年7月9日
利用荧光的发展和成像技术，简单的方法，设计可视化早期病毒与细胞之间的相互作用的病毒，登革热的Alexa Fluor标签的进步。
本实验的总体目标是荧光标记登革热病毒以进行显微镜研究。准备必要的缓冲液并用蔗糖垫纯化登革热病毒，在标记缓冲液中重组 Amy React Alexa 流式染料和登革热病毒。用 100 微摩尔的 Alexa 流标记登革热病毒。
死亡 1 小时，然后停止与子试剂的标记反应。通过大小排阻柱纯化标记登革热病毒。通过噬菌斑测定重新滴定标记的病毒，并通过免疫荧光测定估计标记程度。
大家好，我是来自 DSO 国家实验室的 Sam Jang，在新加坡国立大学医学院毕业后在 Dr.Wee 的实验室工作，从事新发传染病项目的工作。今天，我将向您展示如何使用 Amy 反应性 Alexa 流感染料对 Denki 病毒进行荧光标记以进行成像研究。Alexa，流感死亡，具有优越的稳定性，并且比荧光素和反胃菜等常见饮食对 pH 值敏感，使其成为研究病毒细胞摄取和内体运输的理想选择。
Alexa 缺陷标记的登革热病毒将有助于理解登革热的发病机制。那么让我们开始吧。在标记反应之前，根据书面方案制备新鲜的标记缓冲液和终止试剂，并通过蔗糖垫纯化登革热病毒，将适量纯化的登革热病毒加入微量离心管中的标记缓冲液中，以达到每毫升 3 亿个形成单位的浓度。
这可以按比例扩大。用于病毒的批量标记。在标记反应之前，在标记缓冲液中将冻干的 Alexa 地板染料重构至 1 毫摩尔。
从此步骤开始，尽量减少暴露在光线下。出于演示目的，Alexa 地板染料将不受 800 微升 1 毫摩尔的光照保护。Alexa 流向稀释的登革热病毒，同时用微型移液器吸头轻轻搅拌。
在室温下避光孵育 1 小时，1 小时后每 15 分钟轻轻倒置一次，短暂离心试管。取 800 μL 的子区域，同时用微量移液器轻轻凝视，在室温下再孵育 1 小时。每 15 分钟通过温和倒置进行避光。
同时，它将纯化柱等同于 25 毫升 HNE 缓冲液。孵育 1 小时后，将标记的病毒涂在色谱柱上并开始收集流出液。用 HNE 缓冲液填充色谱柱。
一旦所有标记的病毒都进入基质，丢弃前 2.5 mL 流出物，并收集接下来的 2 mL 标记病毒组分。Ecor 并在零下 80 摄氏度下看到了纯化的标记病毒。通过噬菌斑测定确定标记病毒的标题。
在典型的实验中，应观察到病毒标题下降不到 10 倍。标记后，应进行免疫荧光测定以评估标记程度。为此，使用血细胞计数器计数病毒细胞，并将适当体积的细胞添加到生长培养基中，以达到每毫升 50， 000 个细胞的密度。
在包含无菌玻璃盖的四孔板中每孔看到 1 毫升病毒细胞。睡。将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳中孵育过夜。从培养箱中取出板，从孔中吸出旋后器，实际上是在 37 摄氏度下，在 100 微升体积中含有大约 1 MOI 标记病毒的细胞 10 分钟。
取出接种物，每孔用 0.5 毫升 PBS 缓冲液洗涤细胞。Spirit dis 并再次重复此过程两次。在室温下，每孔用 200 μL 3% 固定细胞，用于多高度，放置 30 分钟。
用每孔 0.5 ml PBS 缓冲液洗涤细胞 3 次。在室温下用活化溶液将细胞均匀化 30 分钟。使用细镊子从井中取出盖板。
通过对盖子的边缘进行 DPing 来排出多余的液体。滑到白色的纸上。放置盖子的单元格侧。
在一块香水上加入 25 μL 登革热 e 蛋白抗体。在潮湿的室温下避光孵育 1 小时。接下来，将盖玻片转移到六孔板中，并在每种油中加入 2 毫升洗涤缓冲液。
抽吸旋后肌。最后一次洗涤后，再重复这些洗涤步骤两次。使用 Fine fp 从孔中取出盖玻片。
通过浸入盖子的边缘来排出多余的液体。靠着纸巾滑倒。放置盖子的单元格侧。
睡在 25 微升 Alexa 地板上，在一块香水上放置 8 8 抗小鼠二抗。孵育完成后，在室温避光的潮湿室中孵育 45 分钟，将盖上睡眠转移到六孔板中，并用 2 毫升洗涤缓冲液洗涤细胞 3 次 最后一次洗涤后每次洗涤。从孔中取出盖玻片，用离子水冲洗一次。
通过蘸纸来排出多余的液体。用 8 微升温和的封片剂将盖片擦到显微镜灯上。让镶样溶液在夜间空气中凝固 4 摄氏度。
样品现在可以使用荧光显微镜或共聚焦显微镜进行可视化。将一小滴浸油滴在盖睡眠的表面并固定显微镜。滑到显微镜载物台。
调整载物台，直到显微镜物镜与浸油接触。要获得清晰的图像，请使用 Zes Zen 软件关闭环境光。单击目测器，通过显微镜的目镜直接观察样品。
找到一个带有单元格的填充并调整焦点。现在切换到采集模式。为了最大限度地减少花卉瀑布之间的串扰，请为 Alexa floor 4、8、8 和 finite four 选择单独的轨道。
染料和套装采集到顺序激发和检测。调整激光功率增益和偏移，以确保图像不会曝光过度或曝光不足。使用共定位函数捕获图像并分析感兴趣区域。
重叠系数可用于估计 Alexa Flo 染料对登革热病毒的标记程度。对病毒细胞进行简单的免疫荧光测定，标记程度可以从标记病毒的共定位来估计 与抗 e 蛋白一起，抗抗体染色重叠共效范围为 0.65 至 0.8，表明大约 65% 至 80% 的方差用 Alexa 地板染料标记。为了使标记程序成功，重要的是准备标记缓冲液并开始新鲜发酵，并在标记前重新配制 Alexa 地板消化物。
可以使用的染料浓度进一步优化以满足您的需求。这种水平标记登革热病毒的方法可能适用于标记其他病毒。就是这样。
感谢您的观看，祝您的标记实验好运。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概览
本研究介绍了一种使用Alexa Fluor进行登革病毒荧光标记的方法，用于显微镜分析。该方法允许观察病毒与宿主细胞之间的早期相互作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 病毒学
- 荧光显微镜
- 细胞生物学
背景
- 登革病毒是一个重大的全球健康问题。
- 了解病毒-细胞相互作用对开发抗病毒策略至关重要。
- 荧光标记增强了这些相互作用的可视化。
- 成像技术的进步促进了详细的研究。
研究目的
- 开发一种可靠的登革病毒标记方法。
- 可视化登革病毒与宿主细胞之间的相互作用。
- 改善对病毒感染早期阶段的理解。
使用的方法
- 准备标记所需的缓冲液。
- 使用蔗糖缓冲液纯化登革病毒。
- 在标记缓冲液中重组Alexa Fluor染料。
- 用特定浓度的染料标记病毒。
主要结果
- 成功地对登革病毒进行了荧光标记。
- 在显微镜下可视化了病毒-细胞相互作用。
- 通过免疫荧光测定评估标记效率。
- 使用斑块测定法重新滴定标记的病毒。
结论
- 该方法提供了一种简单有效的登革病毒标记方法。
- 荧光标记有助于研究病毒-宿主相互作用。
- 该技术可以应用于其他病毒研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Direct fluorescent labeling of dengue virus with Alexa Fluor enables precise visualization of virus-cell interactions, supporting early-stage mechanistic studies in infectious disease research. This capability enhances predictive confidence in target validation and informs translational strategies for antiviral and vaccine development. The method's compatibility with live virus and quantitative imaging strengthens its value across discovery and preclinical inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of virus entry and trafficking mechanisms in host cells.
- Supports biological de-risking by clarifying early infection events relevant to pathogenesis.
- Facilitates functional target validation through visualization of labeled virus interactions.
- Improves predictive confidence for downstream therapeutic hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized approach for preparing fluorescently labeled virus for imaging-based assays.
- Ensures reproducibility and quantitative assessment of labeling efficiency via immunofluorescence and plaque assays.
- Enables scalable batch labeling suitable for high-content screening platforms.
- Supports reliable evaluation of antiviral compound effects on virus-cell entry and trafficking.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by preserving virus infectivity post-labeling.
- Enables continuity from mechanistic discovery to preclinical validation of intervention strategies.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing quantitative imaging readouts.
- Facilitates biomarker alignment through colocalization analysis of viral and cellular markers.
Pipeline & Workflow Integration
This labeling method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting hypothesis-driven studies, assay development, and translational research on viral pathogenesis.
- Discovery Biology: Advances mechanistic understanding of virus-host interactions through direct visualization and quantitative colocalization.
- Screening: Delivers reproducible, labeled virus preparations for imaging-based screening of antiviral candidates.
- Analytics: Provides quantitative outputs such as overlap coefficients and infectivity titers for comparative analysis.
- Translational Research: Maintains functional virus for use in disease-relevant cellular models and biomarker studies.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly adaptable protocol for labeling other enveloped viruses in diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in early-stage virology research.
- Operational Value: Standardizes virus labeling and imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation by enabling robust target validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of antiviral and vaccine candidates based on quantitative imaging data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in virology, fluorescence microscopy, and quantitative image analysis.
- Needs access to high-quality imaging platforms and analytical software for colocalization studies.
- Demands rigorous buffer preparation and dye handling to ensure reproducibility and minimize cytotoxicity.
- Adaptable to other enveloped viruses with protocol optimization for specific viral systems.
- Dependent on maintaining virus viability and labeling efficiency for downstream applications.
