DNA甲基化:亚硫酸氢修改和分析
2011年10月21日
DNA甲基化分析的黄金标准是亚硫酸氢转换的DNA基因组测序。 5 - 甲基胞嘧啶（5 - MEC）亚硫酸氢在酸性条件下脱氨相比，这种方法需要利用胞嘧啶的敏感性增加。后PCR扩增目标基因组DNA甲基化的胞嘧啶甲基化的胞嘧啶可以区分。
该程序的总体目标是通过对亚硫酸盐转化的 DNA 进行基因组测序，实现 CPG 二核苷酸的 DNA 甲基化分析。这是通过首先变性双链 DNA 来实现的，以便进行亚硫酸氢盐转化反应。第二步是通过亚硫酸氢盐脱氨将基因组 DNA 中所有未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。
该反应涉及三个阶段。第一种是通过向五个六双键中添加亚硫酸乙酯来硫酸化胞嘧啶残基。其次，亚硫酸盐衍生物对胞嘧啶的水力脱氨作用通过亚硫酸盐衍生物产生 SSL，第三，通过碱处理去除磺酸盐基团导致 SSL 残留。
接下来，通过亚硫酸氢盐转化特异性引物和 PCR 扩增扩增靶区域。最后一步是 PCR 产物的克隆和测序，以获得整个 DNA 分子甲基化的单核苷酸分辨率。最终，结果显示，在酸性条件下，与五甲基胞嘧啶相比，细胞因子对硫酸氢盐脱氨的敏感性增加，基因组 DNA 中 CPG 二核苷酸的 DNA 甲基化。
与 Southern 血液分析等现有方法相比，该技术的主要优点是它可以实现 d 甲基化的单核苷酸分辨率。这种方法可以帮助回答表观遗传学领域的关键问题，例如 DNA 甲基化在癌症等人类疾病中的作用。要制备用于亚硫酸氢盐转化的 DNA 样品，首先将 2 μg 基因组 DNA 与亚硫酸氢盐、DNA 裂解缓冲液和总体积为 18 μL 的 DNA 在 37 摄氏度下孵育 1 小时。
然后通过添加 2 μL 新鲜制备的 3 摩尔氢氧化钠至终浓度为 0.3 摩尔来使基因组 DNA 变性。将样品在 37 摄氏度下在水浴中孵育 15 分钟，然后在 90 摄氏度下孵育 2 分钟。在加热块中，立即将试管放在冰上 5 分钟，将试管离心 10 秒至 10， 000 Gs，以确保 DNA 位于试管底部，变性 DNA 样品现在已准备好用于 B 细胞对抗脱氨，接下来将进行演示。
在硫酸化和水解脱氨反应之前，通过亚硫酸盐 pH 值为 5.0 制备 10 毫摩尔喹醇和饱和间位钠的新鲜溶液。由于亚硫酸盐的 meta 钠是饱和溶液，因此小块可能仍未溶解。将亚硫酸盐 208 μL 的间位钠和 12 μL 的喹醇添加到 20 μL 的变性 DNA 中，最终体积为 240 μL。
涡旋试管并离心 10 秒钟，以确保所有液滴都位于试管底部。用矿物油覆盖样品。将样品在 55 摄氏度下在水浴中孵育 4 至 16 小时，具体取决于要转化的 DNA 的数量和质量。
重要的是，亚硫酸氢盐转化应在黑暗中进行，以避免氧化。在适当的孵育时间结束时，在微量离心机中短暂旋转试管，以确保所有液体都在试管底部。然后小心地从试管底部吸出 DNA 溶液，不要吸走任何矿物油。
对于下一步，我们的实验室使用 promega wizard DNA 纯化系统。向 DNA 样品中加入 1 mL 树脂，倒置试管混合，然后将溶液移液到连接到脱盐柱的注射器中。最后，为了去除任何游离的亚硫酸氢盐离子，将亚硫酸氢盐处理的 DNA 通过脱盐柱，并加入 50 μL Milli Q 水。
下一步是通过海水淡化从尿嘧啶环中去除亚硫酸氢盐阁楼。为此，向每个亚硫酸氢盐处理的 DNA 样品中加入 5.5 μL 新鲜制备的 3 摩尔氢氧化钠，最终浓度为 0.3 mol。然后将样品在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。
短暂离心样品，然后向每个样品中加入 1 微升 TRNA。通过添加乙酸铵至终浓度为 3 摩尔来中和溶液。接下来乙醇沉淀 DNA。
加入冰冷的 100% 乙醇 330 微升，倒置混合均匀。在零下 20 摄氏度下放置 1 小时，然后在 14， 000 GS 下在 4 摄氏度下离心 15 分钟。然后去除所有痕量上清液，将沉淀的 DNA 风干约 20 分钟。
风干后，几乎不可能看到沉淀，将 DNA 沉淀重悬于 50 微升 0.1 XTE 或水中，在此期间在室温下放置约两个小时，偶尔涡旋试管以确保 DNA 溶解，然后快速离心。DNA 溶解后，可以在 -20 摄氏度下储存 1 到 10 年，具体取决于 DNA 的数量和质量，或立即使用。对于 PCR 扩增，引物优化是该程序中最困难的方面。
因此，提供了以下指南来帮助确保引物设计成功。为了说明这些指南，靶序列已通过亚硫酸盐转化，因此当写入转化的胞嘧啶显示为蓝色 T 而未转化的 CPG 位点显示为红色时，cgs 引物的长度应为 24 至 30 个碱基对，以确保特异性。引物在 50 摄氏度以上应具有类似预测的 TM，并且相差不超过 1 到 2 摄氏度。
引物应包含多个约 25% C 至 T 碱基，以确保转化特异性。在引物序列中，应避免三个主要末端应为 C 到 T 的最终碱基，以确保扩增转化的 D-N-A-C-P-G 二核苷酸，以避免对甲基化未甲基化或未转化模板的潜在偏倚。但是，如果不可避免，应将 CPG 位点中的胞嘧啶替换为 Y，以帮助确保转化 DNA 的无偏倚扩增。
最后，如果需要，设计巢式或半巢式引物对，以确保 PCR 反应的特异性或灵敏度。制备 25 微升等分试样的 PCR 扩增反应混合物以进行优化。每个反应都包含由亚硫酸盐转化的基因组 DNA DPS 引物、氯化镁、氯化钾 tris 盐酸盐 pH 8.3 anac 聚合酶，用于检测甲基化或未甲基化材料的扩增偏倚性。
使用 50 50 甲基化未甲基化完全亚硫酸氢盐转化的对照样品检测亚硫酸氢盐转化的比例 PCR 扩增。温度梯度热循环仪中的特异性引物和 PCR 反应混合物将运行反应设置为从引物 TM 开始的梯度加或负 3 摄氏度，穿过 8 到 10 个试管，涡旋试管并在微量离心机中短暂旋转，然后将它们放入热循环仪中。该图显示了一种 agros 凝胶，具有来自 50% 甲基化和未甲基化 DNA 混合物的温度梯度 PCR 扩增曲线。
标有 T 泳道 2、5 和 8 的 PCR 扩增子和泳道已用限制性内切酶处理，该内切酶仅消化甲基化 DNA。最佳 PCR 扩增条件应按比例扩增甲基化和非甲基化扩增子，且无偏差，从而产生等量的切割和未切割的 PCR 产物，如图所示。非偏倚扩增的最佳热循环条件为 55.6 摄氏度。亚硫酸氢盐 DNA 的完全转化可以通过用胞嘧啶位点特异性酶消化来分析，该酶只会消化未转化的 DNA 泳道 3、6 和 9。
此处显示亚硫酸氢盐 DNA 完全转化，即所有 3 个泳道、3 号泳道、6 号泳道和 9 中均无切割的 DNA。该实时解离图显示，甲基化和未甲基化 DNA 红橙线 50 50 混合物的比例相等，而完全甲基化的粉色线 m 和未甲基化的 DNA 绿线 U 的对照扩增分别在 82.9 摄氏度和 86.9 摄氏度下解离。这表明不存在基于不同分子解离温度的扩增偏倚。
亚硫酸氢盐处理样品扩增得到的 PCR 片段可通过 agros 凝胶电泳观察并测序。此处直接显示的是来自三种不同细胞系的序列轨迹，其中 CPG 位点以黄色细胞系 X 突出显示，在所有三个 CPG 位点均显示 100% 甲基化，其中细胞系 Y 和 Z 显示不同程度的甲基化，如此处所示的重叠 GA 信号所示。图 4 A 是来自三种不同细胞系的序列轨迹，其中 CPG 位点以黄色突出显示。
在对单个克隆进行直接测序后，可以在亚硫酸氢盐图中列出单个分子的甲基化状态。为了可视化异质性甲基化，单个 CPG 位点的甲基化密度以红色显示。在这个代表性的亚硫酸氢盐图中，样品的高通量定量甲基化分析。
使用后序列 epi typer 技术可以产生依赖于甲基化胞嘧啶存在的特定光谱，如本例所示 图 5 A.然后可以以铭文的形式推断样品中比率的总结 图 5 B.此示例显示了四种不同细胞系在每个 CPG 位点的 DNA 甲基化百分比。最后，一个甲基化图摘要图 5 C 可以从 epigram 中推导出来 在其发展之后。这项技术为表观遗传学领域的研究人员探索 DNA 甲基化及其在人类疾病中的作用铺平了道路。
概述
本文概述了一种使用亚硫酸盐转化DNA的基因组测序进行CPG二核苷酸DNA甲基化分析的程序。该方法能够区分未甲基化和甲基化的胞嘧啶，实现单核苷酸分辨率。
关键研究组成部分
科学领域
- 表观遗传学
- DNA甲基化
- 基因组测序
背景
- DNA甲基化在基因调控中起着至关重要的作用。
- 传统方法如Southern印迹不具备单核苷酸分辨率。
- 亚硫酸盐转化提高了甲基化检测的灵敏度。
- 该技术可以为人类疾病（包括癌症）提供洞见。
研究目的
- 开发一种可靠的方法来分析单核苷酸分辨率的DNA甲基化。
- 探索DNA甲基化在表观遗传学中的意义。
- 改进现有的方法以提高甲基化检测的准确性。
使用的方法
- 双链DNA的变性。
- 亚硫酸盐脱氨基作用将未甲基化的胞嘧啶转化为尿苷。
- 使用亚硫酸盐特异性引物的PCR扩增。
- PCR产物的克隆和测序分析。
主要结果
- 成功将未甲基化的胞嘧啶转化为尿苷。
- 在甲基化分析中实现了单核苷酸分辨率。
- 展示了相对于传统方法的优势。
- 为未来的表观遗传学研究提供了框架。
结论
- 该方法允许对DNA甲基化进行精确分析。
- 它对理解基因调控有重大意义。
- 该技术可以帮助研究与癌症等疾病相关的研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Accurate detection of DNA methylation at single nucleotide resolution is critical for target validation in epigenetic drug discovery, enabling mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses. This method supports predictive confidence in preclinical models by linking methylation patterns to disease states such as cancer, informing portfolio prioritization. It provides a reproducible foundation for translational biomarker development and assay standardization across discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by resolving methylation status at individual CpG dinucleotides.
- Operational Value: Provides quantitative, nucleotide-resolution data to de-risk epigenetic targets before lead identification.
- Predictive Value: Supports disease-relevant system modeling by correlating methylation with gene expression in cancer and differentiation models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates methylation maps that serve as standardized inputs for epigenetic screening campaigns.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through controlled bisulfite conversion and sequencing readouts.
- Scalability: Enables platform reuse across cell lines and tissue types for longitudinal methylation profiling.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links methylation changes to phenotypic outcomes in preclinical disease models.
- Operational Value: Facilitates cross-functional alignment between discovery and preclinical teams via shared epigenetic datasets.
- Risk Mitigation: Informs go/no-go decisions by identifying epigenetic drivers of pathology early in the pipeline.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead optimization, providing epigenetic context that improves decision fidelity at each stage.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by clarifying whether observed phenotypes are methylation-dependent.
- Screening: Delivers quantitative methylation outputs that enable compound effect assessment in epigenetic assays.
- Analytics: Produces single-nucleotide methylation ratios that allow statistical comparison across treatment conditions.
- Translational Research: Connects epigenetic findings to biomarker strategies by identifying differentially methylated regions in disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized epigenetic profiling capability applicable to multiple therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in epigenetic target validation through base-resolution methylation data.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of epigenetic measurements across sites and studies.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling earlier identification of non-viable epigenetic targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by integrating epigenetic stability into preclinical candidate selection.
Implementation Considerations
- Requires expertise in epigenetics, molecular biology, and nucleic acid handling.
- Dependent on thermal cyclers, sequencing platforms, and bisulfite conversion reagents.
- Necessitates standardized protocols for DNA denaturation, conversion, and cleanup to ensure consistency.
- Must account for DNA degradation risks during prolonged bisulfite incubation and alkaline desulfonation steps.
- Requires validation across diverse genomic contexts (e.g., CpG islands, repetitive regions) to ensure broad applicability.
