DNA甲基化：亚硫酸氢盐修饰与分析

本实验的总体目标是通过对亚硫酸盐转化后的DNA进行基因组测序，实现对CpG二核苷酸的DNA甲基化分析。该目标首先通过使双链DNA变性，以使亚硫酸盐转化反应得以进行；第二步是通过亚硫酸盐脱氨作用，将基因组DNA中所有未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。

该反应包含三个阶段。第一阶段是通过将亚硫酸氢盐加成到胞嘧啶残基的五、六位双键上，使其发生磺化；第二阶段是亚硫酸氢盐衍生物对胞嘧啶进行水解脱氨，生成亚硫酸氢盐修饰的胞嘧啶（SSL）；第三阶段是通过碱处理去除磺酸基团，最终形成亚硫酸氢盐修饰的尿嘧啶残基（SSL）。

接下来，使用亚硫酸氢盐转化特异性引物并通过PCR扩增目标区域。最后一步是克隆并测序PCR产物，从而在DNA分子范围内获得单核苷酸分辨率的甲基化信息。最终结果表明，通过利用胞嘧啶在酸性条件下对亚硫酸氢盐脱氨作用的敏感性高于5-甲基胞嘧啶的特性，可检测基因组DNA中CPG二核苷酸的DNA甲基化状态。

与现有的南方墨点分析等方法相比，该技术的主要优势在于能够实现单核苷酸分辨率的DNA甲基化检测。该方法有助于回答表观遗传学领域中的关键问题，例如DNA甲基化在癌症等人类疾病中的作用。为进行亚硫酸氢盐转化而准备DNA样本时，首先将两微克基因组DNA与亚硫酸氢盐、DNA裂解缓冲液混合，总体积为18微升，在37摄氏度下孵育一小时。

然后通过加入2微升新配制的3摩尔氢氧化钠，使基因组DNA变性，终浓度为0.3摩尔。将样品置于水浴中37摄氏度孵育15分钟，随后在90摄氏度孵育2分钟。在加热模块中，立即把离心管置于冰上冷却5分钟，以10,000 ×g离心10秒，确保DNA沉降至管底。此时，变性的DNA样品已准备好进行B细胞脱氨反应，下一步将对此进行演示。

在进行硫酸化和水解脱氨反应之前，配制新鲜的10毫摩尔喹啉溶液和饱和亚硫酸氢钠溶液（pH 5.0）。由于亚硫酸氢钠为饱和溶液，可能会有少量团块未完全溶解。将208微升亚硫酸氢钠溶液和12微升喹啉加入20微升变性DNA中，最终体积为240微升。

涡旋混匀各管，并离心10秒，确保所有液滴均位于管底。在样品上层覆盖矿物油。根据待转化DNA的数量和质量，将样品置于55摄氏度水浴中孵育4至16小时。

亚硫酸氢盐转化过程必须在避光条件下进行，以避免氧化。在完成相应的孵育时间后，将离心管在微量离心机中短暂离心，以确保所有液体均位于管底。然后小心地从管底吸取DNA溶液，注意不要吸入任何矿物油。

接下来的步骤中，我们实验室使用Promega Wizard DNA纯化系统。向DNA样品中加入一毫升树脂，倒置离心管以充分混匀，然后将溶液用移液器转移至连接脱盐柱的注射器中。最后，为去除残留的亚硫酸氢根离子，将经亚硫酸氢盐处理的DNA通过脱盐柱，并用50微升Milli-Q水洗脱。

下一步是通过脱盐去除尿嘧啶环上的亚硫酸盐加合物。为此，向每个经亚硫酸盐处理的 DNA 样本中加入 5.5 µL 新鲜配制的 3 M 氢氧化钠，使终浓度达到 0.3 M。然后将样本在 37 °C 下孵育 15 分钟。

将样品短暂离心，然后向每个样品中加入一微升 TRNA。加入乙酸铵至终浓度为 3 摩尔，以中和溶液。接着用乙醇沉淀 DNA。

加入330微升冰冻的100%乙醇，颠倒混匀。在-20摄氏度下放置1小时至过夜，然后在4摄氏度下以14,000 ×g离心15分钟。随后彻底去除上清液，并将沉淀的DNA在空气中干燥约20分钟。

空气干燥后，DNA沉淀几乎难以看见，将其重悬于50 µL的0.1 × TE缓冲液或水中，在室温下静置约两小时。在此期间，需不时涡旋振荡离心管，以确保DNA充分溶解，随后进行短暂离心。待DNA完全溶解后，可于-20 °C保存1至10年，具体保存时间取决于DNA的浓度和质量，或可立即使用。在PCR扩增过程中，引物优化是该实验步骤中最困难的部分。

因此，以下提供若干设计原则，以帮助确保引物设计的成功。为说明这些原则，目标序列已通过亚硫酸盐转化处理，因此在书写时，已转化的胞嘧啶显示为蓝色的T，未转化的CpG位点显示为红色的cgs。引物长度应为24至30个碱基对，以确保特异性。引物的预测熔解温度（Tm）应均高于50摄氏度，且彼此之间差异不应超过1至2摄氏度。

引物应包含多个约25%的C至T碱基，以确保转化的特异性。引物3'端的最后一个碱基应为C或T，以确保转化后DNA中CpG二核苷酸的扩增。引物序列中应避免出现CpG二核苷酸，以防止对甲基化、非甲基化或未完全转化模板的扩增产生潜在偏倚。然而，若无法避免，则应在CpG位点将胞嘧啶替换为Y，以帮助确保对转化后DNA的无偏扩增。

最后，如有需要，设计巢式或半巢式引物组以确保PCR反应的特异性或灵敏度。为优化实验，制备25 µL的PCR扩增反应混合物。每个反应包含经亚硫酸氢盐转化的基因组DNA、DPS引物、氯化镁、氯化钾、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（pH 8.3）以及anac聚合酶，用于检测甲基化或非甲基化材料的扩增偏好性。

使用50%甲基化与50%非甲基化的完全亚硫酸氢盐转化对照样品，检测亚硫酸氢盐转化后PCR扩增的比例性。采用特异性引物和PCR反应混合物，在梯度温度循环仪中进行反应，设置反应温度梯度，范围为引物TM值上下各±3°C，跨越8至10个反应管。在将反应管放入热循环仪之前，需涡旋振荡混匀并短暂离心。该图显示了由50%甲基化与50%非甲基化DNA混合物进行梯度PCR扩增后所得的琼脂糖凝胶电泳结果。

PCR扩增产物及标记为T的泳道（泳道2、5和8）已用一种限制性内切酶处理，该酶仅切割甲基化的DNA。最佳PCR扩增条件应按比例且无偏倚地扩增甲基化和非甲基化的扩增产物，从而产生等量的被切割和未切割的PCR产物，如图所示。实现无偏倚扩增的最佳热循环条件为55.6摄氏度。亚硫酸氢盐转化完全的DNA可通过使用一种特异性识别胞嘧啶位点的酶进行消化来分析，该酶仅切割未转化的DNA（泳道3、6和9）。

完全的亚硫酸氢盐DNA转化在此表现为所有三个泳道（第3、6和第9泳道）中均无切割的DNA条带。该实时解离曲线图显示，甲基化与非甲基化DNA的等量混合物（红橙色线，50:50混合）与完全甲基化对照（粉红色线，M）和非甲基化DNA对照（绿色线，U）的扩增产物比例相等，其解离温度分别为82.9°C和86.9°C。这表明不同DNA分子的解离温度不会导致扩增偏好性。

对经亚硫酸氢盐处理的样本进行扩增后得到的PCR片段，可通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，并进行测序。此处直接展示的是三个不同细胞系的测序峰图，其中CPG位点以黄色高亮显示：细胞系X在全部三个CPG位点均显示100%甲基化，而细胞系Y和Z则显示出不同程度的甲基化，表现为图中重叠的GA信号。图四A为三个不同细胞系的测序峰图，CPG位点以黄色高亮显示。

在对单个克隆进行直接测序后，可将各个分子的甲基化状态汇总为一幅亚硫酸盐测序图谱。为直观展示甲基化的异质性，各单个CpG位点的甲基化密度以红色显示。在此代表性亚硫酸盐测序图谱中，展示了对一个样本进行的高通量定量甲基化分析。

利用Sequenome EpiTyper技术可产生特定的质谱图谱，该图谱依赖于甲基化胞嘧啶的存在，如本示例图五A所示。随后，可将样本中甲基化比例的汇总数据以表观遗传图谱（epigram）的形式呈现，如图五B所示。此示例展示了四种不同细胞系在各个CpG位点的DNA甲基化百分比。最终，在生成表观遗传图谱后，可进一步获得甲基化图谱的汇总图，如图五C所示。该技术为表观遗传学领域的研究人员探索DNA甲基化及其在人类疾病中的作用奠定了基础。