斑马鱼单细胞命运图谱绘制

以下实验的总体目标是对斑马鱼胚胎中选定的单个细胞进行命运图谱绘制和谱系追踪。该目标通过将笼锁型荧光素化学偶联至高分子量葡聚糖来实现。随后，将制备好的笼锁型荧光素葡聚糖微量注射到斑马鱼胚胎中，然后利用双光子吸收对选定细胞进行光活化。

胚胎光激活后，进行免疫组织化学分析以检测解笼荧光素葡聚糖，从而对激活的细胞进行命运图谱绘制。最终，该方法可用于确定光激活单个细胞的谱系贡献及其在组织中的定位。与现有方法（如标准荧光显微镜技术）相比，该技术的主要优势在于能够对单个细胞进行差异化标记，用于精确的命运图谱分析。

该方法可帮助我们回答发育生物学中的关键问题，例如未分化的前体细胞如何贡献于不同类型的组织。由于胚胎固定和光激活步骤仅通过文字描述难以掌握，因此可视化演示至关重要。在开始实验之前，先合成笼锁型荧光素葡聚糖，并将其储存在金属箔包裹的试管中。随后，在胚胎发育至一到二细胞阶段时，将其显微注射入合成的笼锁型荧光素葡聚糖。

当胚胎发育至适当阶段后，对其进行包埋。然后将包埋好的胚胎置于低熔点琼脂糖中，用于光激活实验。待琼脂糖凝固后，加载 LSM 510 软件。

将透明黄色滤光片放入白光光路中，然后选择扫描新图像并点击启动专家模式。选择激光选项卡，打开氩离子和米钛激光光源。将米钛激光波长设置为740纳米。

接下来，选择配置选项卡。设置氩离子和米太激光器的光路配置。然后选择扫描选项卡。

将物镜更换为20倍0.8。在通道选项卡中，点击“最大值”以设置模式方法和行平均数分别为“最大值”和“1”，并取消选择除mi tai以外的所有激光源。接下来，在光路中放置一个功率计，然后选择“con”按钮以启动连续扫描。

将透射百分比调整至功率计读数为平均激光功率47毫瓦。然后在通道选项卡下点击停止按钮以终止扫描。取消选择mi tai激光源，并选择argonne iron。

然后再次在通道选项卡下选择快速XY按钮，调节针孔。检测增益，放大偏移量，并再次放大，以优化氩铁激光器的成像质量。使用载物台控制器找到待激活的细胞并聚焦，然后点击停止按钮。使用裁剪工具裁剪已激活的细胞，使模式选项卡下的裁剪因子显示为50至70。

然后，在通道选项卡下点击停止按钮以结束扫描。在模式选项卡下，取消选择氩离子激光器，并选择My Tai激光器。将扫描速度设置为31.46秒。

然后选择单次按钮，以启动对选定细胞中笼锁型荧光素葡聚糖的双光子激活扫描。激活后，转到通道选项卡，取消选择mi tai激光器，重新选择氩离子激光器。接着在模式下，将缩放系数设置为1。下一步。

在“速度”标题下，单击“最大”按钮以设置最快的扫描速度。要查看光激活区域，请选择快速 xy。然后选择“通道”选项卡，调整针孔并再次检测，确认光激活区域未被激光消融。

按照随附文稿中所述方案制备光激活胚胎以进行解笼荧光素葡聚糖的免疫检测后，用PBT洗涤胚胎六次，再用AP缓冲液洗涤两次。然后将胚胎转移至含有AP缓冲液的九孔板中。

接着，吸去AP缓冲液，加入N-B-T-B-C-I-P。通过吸去N-B-T-B-C-I-P溶液来终止染色反应。然后用PBT清洗胚胎。

现在回收胚胎，并在室温下于旋转平台上振荡五分钟。然后用PBT缓冲液再清洗两次。最后将胚胎置于0.6%低熔点琼脂糖中，使用正置复式显微镜观察并采集光激活细胞的图像。

在本图中，左侧为明场图像，右侧为荧光图像，显示的是光激活前显微注射了笼锁型荧光素葡聚糖链的斑马鱼胚胎。如图所示，胚胎左侧明场图像中标记箭头所指的一个体节已被光激活，激活条件为波长740纳米、扫描时间31秒、平均激光功率47毫瓦。在右侧图像中，光激活后可观察到去笼锁的荧光素葡聚糖发出的荧光信号。

利用与上图相同的激光参数，通过免疫检测方法对10体节期胚胎侧板中胚层中一个微小区域的光解封荧光素葡聚糖进行免疫染色。经此处理后，箭头所示的激活区域可被清晰识别，且背景染色极低。

为了更准确地鉴定标记细胞的位置和命运，可以进行额外的分析，例如针对不同组织特异性标志物的免疫染色。利用该技术，可为血管生物学领域的研究人员探索发育中斑马鱼胚胎中静脉前体细胞产生动脉的起源提供途径。请注意，在使用 NBT 和 BCIP 等化学试剂时，它们可能具有极高危险性，因此必须始终佩戴手套。