Name: 图案的使用生物倒装芯片的胚胎干细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T13:21:11.000+00:00
Duration: 5 min 25 s
Description: 了解生物倒装芯片技术，通过PDMS微孔阵列实现胚胎干细胞在基底上的精确定位。该方法可调控细胞间信号传导，适用于细胞生物学、神经科学和生物工程研究。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目EB007278支持。

制备BFC
BFC 通过在 4 英寸硅主模板上模塑聚二甲基硅氧烷（PDMS）制备而成。
制备主模板
<ol>
<li>首先将硅片在130°C下脱水处理30分钟。</li>
<li>将硅片置于匀胶机上，滴加SU8-2050光刻胶（Microchem），以300 rpm/s的加速度加速至3000–4000 rpm，并旋转30秒，分别获得40–30 mm的特征高度。</li>
<li>旋转涂覆后，将硅片置于65°C的热板上，立即升温至95°C，保持5–6分钟，随后降温至65°C。</li>
<li>使用暗场掩模，在接触式光刻对准仪上对硅片进行200 mJ/cm2的紫外光曝光。</li>
<li>曝光后，将硅片再次置于65°C热板上，立即升温至95°C，保持4–5分钟，随后降温至65°C。</li>
<li>使用丙二醇单甲醚乙酸酯（PM acetate）和异丙醇（Isopropanol）对硅片进行显影。</li>
<li>使用六甲基二硅氧烷（Shin-Etsu MicroSi）或十三氟-1,1,2,2-四氢辛基-1-三氯硅烷（t2492-KG, UCT Specialities, Bristol, PA）对硅片进行30分钟的硅烷化处理，以防止PDMS粘附于硅母版上。</li>
</ol>
制备芯片
<ol>
<li>按10:1的比例混合PDMS（Dow Corning，Sylgard 184），将其浇注在母模硅片上（每片约15 g），并在室温下静置过夜使其固化。</li>
<li>将固化的PDMS从硅片上剥离，并使用剃刀片切割出每个芯片。</li>
<li>将每个芯片键合到一块1 cm × 1 cm的显微镜载玻片上，以便于操作。</li>
</ol>
准备使用BFC
<ol>
<li>将BFC在PBS中浸泡过夜，以防止实验过程中培养基被PDMS吸收。</li>
<li>用无尘纸（Kimtech Science）将芯片干燥。</li>
<li>在BFC的图案化表面滴加一滴7.5%牛血清白蛋白（BSA）（约200 µL），然后用移液器吸头刮涂以分散BSA并去除孔中的气泡。</li>
<li>让BSA在BFC表面静置至少0.5小时。理想情况下每15分钟轻轻搅动一次，以防止表面结皮。</li>
<li>为了将BFC适配于35×10 mm的TCPS培养皿（Falcon, 35-3001）内，将TCPS培养皿的边缘从中间切去一半，以便¾英寸文件夹夹（Office Depot）能够夹住培养皿边缘，将芯片与培养皿固定在一起。</li>
<li>从PDMS片材（Silicone Specialty Products）或其他硅胶材料上裁剪一个垫片密封圈（外缘20×20 mm，内缘15×15 mm，厚度250–500 µm），并用镊子将其放置在培养皿上。</li>
</ol>
使用BFC对细胞进行图案化
<ol>
<li>将培养皿、垫圈、BSA包被的芯片以及2个长尾夹在紫外线下灭菌1分钟。</li>
<li>吸除BSA溶液，并用200 mL PBS将BFC清洗两次。</li>
<li>如果您的细胞系需要，可在切割后的TCPS培养皿中加入明胶。否则，在将其贴附到芯片前，先用少量培养基润湿TCPS表面（见下文），以防止腔室内产生气泡。</li>
<li>吸除PBS后，用移液器将200 mL细胞悬液（约1×106 个细胞/mL）加至BFC表面，静置5–10分钟使细胞沉降。</li>
<li>将BFC倾斜约15°角至一个角落，用200 mL移液器缓慢吸除细胞悬液。然后将BFC放平，在对角的另一角落加入100 mL PBS或空白培养基。根据需要，以相同方式再冲洗2–4次，彻底清除孔间区域的细胞。</li>
<li>向芯片表面加入200 mL培养基。吸除TCPS上的明胶或培养基，然后将预先润湿的培养皿翻转，缓慢将BFC推入培养皿中。</li>
<li>在腔室两侧各使用一个长尾夹进行密封。移除长尾夹的金属卡扣，以便翻转后培养皿保持水平。</li>
<li>最后，迅速将整个装置翻转，避免不必要的移动，并立即放入培养箱中。</li>
</ol>

<ol><li>Rosenthal, A., Macdonald, A., Voldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Patterning+Chip+for+Controlling+the+Stem+Cell+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Cell Patterning Chip for Controlling the Stem Cell Microenvironment.</a> Biomaterials. 28, 3208-3216 (2007).</li>
</ol>

尽管本文所述的实验方案及视频展示了使用BFC1对小鼠胚胎干细胞（mESCs）进行图案化，但BFC实际上可用于图案化几乎所有感兴趣的细胞类型。可能需要做的唯一调整是改变微孔的尺寸。根据我们的经验，若要使用BFC对其他细胞类型的单个细胞进行图案化，微孔的直径和高度比未贴壁细胞的直径大10微米时效果最佳。
BFC 还可用于在其他基底（包括其他细胞）上进行细胞图案化，且无需对实验方案进行显著修改。与传统的细胞图案化方法相比，BFC 方法的一个优势在于能够在已有细胞层上进行图案化，因为某些细胞类型（包括小鼠胚胎干细胞和人类胚胎干细胞）在培养中需要支持细胞或饲养层细胞来维持其正确的表型。
我们正在探索BFC的一个应用是利用BFC研究小鼠胚胎干细胞之间的信号传导。通过在具有不同网格间距的方形晶格中接种单个细胞，我们可以调控细胞间信号分子的交换速率。通过制造更大的微孔（直径为40微米），我们还可以在特定位置聚集较多数量的细胞（约2–10个），从而局部改变细胞密度。此外，我们可以将多个小孔紧密排列，形成一种局部细胞密度...

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>硅胶母模</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞培养皿</td><td>Falcon BD</td><td>35-3001</td><td>35 mm</td></tr><tr><td>3/4&quot; 文件夹夹</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>六甲基二硅氧烷</td><td>Shin-Etsu MicroSi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>新项目</td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU8-2050</td><td></td></tr><tr><td>PM 醋酸酯</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td>7.5% 牛血清白蛋白</td></tr></tbody></table>

利用生物翻转芯片对胚胎干细胞进行图案化

Patterning of Embryonic Stem Cells Using the Bio Flip Chip

由可扩散信号和细胞间接触（旁分泌信号）构成的细胞间相互作用在多种生物学过程中至关重要，例如肿瘤生长、干细胞分化以及干细胞自我更新。目前已有多种方法用于在体外调控细胞信号传导。其中一种调控可扩散信号总量的方法是在培养过程中改变细胞接种密度。然而由于细胞接种具有随机性，该方法会导致实际的细胞间距和细胞间接触数量存在较大差异，因而无法精确控制局部微环境。另一种更为特异性的调控细胞信号的方法是使用分子抑制剂或遗传学手段敲低特定的信号蛋白，但这些方法更适合调控少数几种分子。本文中，我们展示了一种新的调控细胞间信号传导的方法，该方法通过在基底上将不同数量的细胞置于指定位置，从而调控细胞簇的局部微环境。此方法为控制细胞间的局部可扩散信号和旁分泌信号提供了互补的手段。本方法利用了生物翻转芯片（Bio Flip Chip, BFC），这是一种微加工制成的硅胶芯片，包含数百至数千个微孔，每个微孔的尺寸可容纳单个细胞或少量细胞。我们仅需通过移液将细胞加入微孔阵列，并洗去未落入孔中的细胞即可完成装填。随后将芯片翻转贴附到基底上，细胞便从微孔中脱落并沉积到基底表面，同时保持其原有的空间排布。待细胞贴附后，芯片可被移除（或保留在原位）。这种细胞图案化方法具有以下独特优势：1）不改变基底的化学性质，从而允许细胞增殖和迁移；2）可在多种基底上实现图案化，包括组织培养级聚苯乙烯、玻璃、基质胶（matrigel）甚至饲养细胞层；3）与传统的微接触印刷技术兼容，可构建含有细胞的细胞外基质微岛。在本视频中，我们演示了利用BFC将小鼠胚胎干细胞图案化接种到组织培养级聚苯乙烯表面的过程。

我们展示了一种将细胞放置在基底特定位置的简单方法。该方法通过将含有填充细胞的微孔的硅胶芯片翻转至基底上来实现细胞图案化。该方法为调控细胞间的可扩散信号和邻近细胞信号提供了一种新途径。

由可扩散信号和细胞间接触（旁分泌信号）介导的细胞间相互作用在众多生物学过程中具有重要意义……

我是尼科尔·米塔尔（nickel Mital）。我是鲍曼实验室的一名研究生。今天我将介绍由我们实验室两位前学生开发的一种装置，称为生物翻转芯片（bio flip chip）。该装置能够将细胞递送至实验者所选择的基底上，并且可按照实验者设定的构型进行排列。该装置本身非常简单，我们这里就有一个，它基本上由一块硅胶材料上的微小孔穴构成。每个孔通常设计为仅容纳单个细胞，但如有需要，我们当然也可以将其做得更大。该装置的制备使得孔的排列方式与细胞最终在基底上的分布位置一致。该装置本身采用软光刻技术制作而成。具体而言，我们使用聚二甲基硅氧烷（PDMS），并用硅晶圆作为模具进行成型。我们这里就有一个这样的模具。该模具晶圆本身是通过标准的光刻技术制作而成，将SU-8光刻胶旋涂到硅晶圆上，然后进行图案化。总之，通过将细胞加入生物翻转芯片的孔中，即可将细胞转移至所选的基底上。随后，将该芯片贴附到目标基底（通常是聚苯乙烯组织培养板）上。最后，将整个组合翻转过来，使细胞从孔中脱落并沉积到基底表面。我是Stephanie Flavin。我是Goldman实验室的一名本科研究员，今天我将演示如何在进行图案化实验的前一天使用生物翻转芯片对细胞进行图案化处理。我们将把PDMS通过等离子体键合到一块一英寸见方的玻璃载片上。然后将芯片正面朝下浸泡在PBS溶液中过夜。我们还将裁剪用于图案化实验的垫圈，并准备将要用到的文件夹夹子。向每个芯片表面加入 200 微升 BSA。轻轻晃动移液枪头以去除气泡，并使 BSA 溶液充分填充孔洞。将芯片置于通风橱内，在紫外光照射下孵育一小时，常规处理即可。孵育一小时后，吸除芯片上的 BSA 溶液，用 200 µL PBS 洗涤每个芯片，并加入 200 µL 传代细胞悬液，细胞密度为 10⁶ 个细胞/毫升。等待 5 至 10 分钟使细胞沉降至微孔中后，用 PBS 冲洗芯片表面。将芯片倾斜至一角，角度约为 15 度，从芯片的底部角落缓慢吸去细胞悬液。将芯片恢复至水平位置，缓慢向顶部角落加入 50 µL PBS。根据需要重复洗涤步骤。当芯片表面的 xls 被完全洗去后，向培养皿内层垫圈中加入约 50 µL 培养基。向每个芯片顶部加入培养基。接着，将培养皿倒置，从一个角落开始倾斜并缓缓放低至芯片表面，然后将培养皿完全压平在芯片上，以避免培养皿与芯片之间产生气泡。在芯片两侧添加长尾夹以固定其位置。移除每个长尾夹的手柄，以便翻转芯片后能平稳地放置在培养皿上。将芯片转移至培养箱并迅速翻转，避免任何不必要的移动。

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图案的使用生物倒装芯片的胚胎干细胞

细胞生物学中的微尺度工程

我们介绍了光漂白方法，包括光漂白后荧光恢复（FRAP）和光漂白过程中的荧光丢失（FLIP），用于监测胚胎干细胞（ES细胞）中染色质蛋白的动力学。染色质蛋白动力学被认为是研究染色质可塑性的手段之一，在多能性细胞中其活性增强。...

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用于研究分化命运空间组织的人类多能干细胞模板微图形化技术

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本逐步实验方案详细描述了用于评估hiPSC-ECs中炎症反应以及在生理流动条件下分析白细胞黏附的实验设置和数据分析方法。...

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本文介绍一种利用DNA编程黏附技术在单细胞分辨率下对细胞进行微图案化的实验方案。该方案采用台式光刻平台在玻璃载片上构建DNA寡核苷酸的图案，随后使用 commercially available...

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