剪切载荷:一个有用​​的工具，用于检查视网膜神经细胞之间的缝隙连接示踪剂耦合程度

以下剪切加载实验的总体目标是在受控照明条件下检查完整视网膜中神经元之间间隙连接示踪剂耦合的程度。第一步是用蘸有神经生物素溶液的锋利刀片切割视网膜，神经生物素是一种示踪分子，可以通过开放间隙连接通道扩散，但不能扩散细胞膜。在第二步中，视网膜在林格氏液中孵育，这允许示踪剂通过开放间隙连接通道扩散。

如果间隙连接耦合较弱，神经生物素荧光将仅限于靠近切口的视网膜神经元。相反，如果间隙连接耦合很强，则会在远离切口的视网膜神经元中检测到荧光。与现有技术相比，切割加载的主要优点是它更容易在完整神经视网膜组织中具有小细胞体的神经元上执行。

完整视网膜组织中单个神经元的电生理研究相比，在切割加载期间控制照明条件也更容易。因为电记录过程中使用的光刺激本身会导致间隙结耦合的变化，所以我实验室的博士后 Chu Choi 博士将证明该技术。在这个过程中，金鱼在手术前在白天在恒定的黑暗中至少一小时，并且以下所有步骤直到视网膜组织固定，也在白天在恒定的黑暗中进行，通过向水族箱水中添加每升 150 毫克甲烷磺酸盐来深度麻醉金鱼。

然后根据联邦和大学的指导方针处死金鱼，小心地去除它的眼球。接下来，去除每个眼球的前部。然后将一张滤纸放在眼睛后部的顶部，并将滤纸和眼睛倒置，使滤纸位于眼睛后部的下方。

现在，轻轻去除眼睛后部，包括深色适应金鱼的巩膜和色素上皮。视网膜用一把细剪刀剪断视神经。神经金鱼，视网膜导向的感光器面朝上，现在应在眼球摘除前连接到滤纸上，同时在从眼睛后部解剖完整的神经视网膜后，鱼正在接受 5 毫升麻醉，用碳酸盐基林格溶液充氧，有或没有测试药物到六孔板的每个孔中。

在持续的黑暗中将视网膜转移到孔中。然后用 Paraform 密封孔，让组织孵育 30 分钟。在切开视网膜之前，将 0.5% 神经生物素溶解在林格溶液中，制备 100 微升示踪剂溶液。

接下来，将神经生物素溶液添加到玻璃培养皿中。然后在纸巾上轻轻敲击视网膜附着的滤纸。要去除多余的振铃，请将剃须刀片浸入神经生物素溶液中，并在视网膜和滤纸上形成垂直的径向切口。

之后，再次将剃须刀片浸入神经生物素溶液中，然后再次切割视网膜。重复此作，每个视网膜最多切割四次。在此步骤中，将视网膜转移到新鲜的林氏体中，含或不含受试药物的培养基中 15 分钟，以允许加载和扩散。

用新鲜的铃声、含或不含测试药物的培养基洗涤 3 次，每次 5 分钟。然后在室温下用 4% 对位甲醛在 0.1 摩尔磷酸盐缓冲溶液中固定视网膜 1 小时。随后，第二天将其放入冰箱中，在 4 摄氏度下用 0.1 摩尔 PBS 洗涤视网膜过夜。

用 2% 链霉亲和素 Alexa 4 88 在 0.1 摩尔 PBS 和 0.3%Triton X 100 中反应视网膜，最终浓度为 10 微克/毫升，并在 4 摄氏度下孵育过夜。第二天。在室温下用 0.1 摩尔 PBS 洗涤视网膜 3 次，每次 10 分钟。

在 PBS 中从滤纸上分离视网膜。然后使用细刷，将视网膜感光器面向上安装在带有矢量屏蔽安装介质的载玻片上。将载玻片转移到激光扫描共聚焦显微镜上，并在每个实验条件下以相同的放大倍率、分辨率和设置拍照，以便比较不同实验条件对间隙功能示踪剂耦合程度的影响。

这是白天在持续黑暗中与白天在持续黑暗中存在一种选择性多巴胺 D 两种受体拮抗剂时光感受器细胞示踪剂耦合的程度。请注意，两张图片中的剃刀切口都在左侧。尽管单个图像可能包含所有标记的单元格，但建议收集感兴趣区域的 Z 堆栈并将其折叠为显示的单个图像。

这是当一个人按顺序通过这样的 Zack 时，感光细胞示踪剂耦合的程度。请注意，此图像中的剃刀切口位于右侧。要在 LSM 图像浏览器中量化示踪剂耦合的程度，请打开图像，然后单击导出并将图片保存为 TIF 16 位非压缩文件比例尺应包含在使用 NIH 图像 J 软件的 TIFF 图像中。

从孔安装视网膜的低放大倍率图像中测量 Alexa 4 88 标记的神经生物素的荧光强度。使用 Image J 软件打开 TIFF 文件，然后绘制一条与比例尺对应的直线。接下来，转到 analyze，设置 scale，然后输入已知的距离和长度单位。

然后点击 Ok.现在，荧光测量值可以用校准单位（如毫米）表示。然后，使用矩形选择工具选择感兴趣的区域。

荧光峰应位于所选图像的左边框。确保右边界附近没有荧光信号。单击分析并绘制在恒定黑暗中获得的日间控制数据的剖面图。

具有指数衰减的曲线从左到右显示。然后点击 复制 在弹出窗口中并将其粘贴到 Excel 中。现在有两列，一列显示距切口的距离，另一列显示荧光强度与距切口的距离的函数关系。

作为比较，上述步骤是在白天持续黑暗中获得的数据中重复的。在存在 spit bro 的情况下，将每个原始荧光值除以最大荧光值以获得相对荧光强度。复制对应于与切割距离和相对荧光强度相对应的两列，然后将它们粘贴到原始软件中。

这些步骤同时针对 daytime control 和 daytime spit 显示。此时的运行数据使结果与指数衰减拟合。第一个函数，使用 T 检验或 Inova 比较不同实验条件下的空间常数值。

显示了白天控制、白天 pip rone 和夜间控制数据的指数函数和统计分析以进行比较。显示。以下是白天 A、晚上 B 和白天在选择性多巴胺 D 两个受体拮抗剂存在的情况下，黑暗适应金鱼视网膜中感光细胞示踪剂偶联程度的示例，如切割加载技术所揭示的那样。所有共聚焦图像均使用相同的设置拍摄以进行比较。

在该图中，三种实验条件的荧光强度绘制为距切割距离的函数，并由指数函数拟合。切割加载技术用于通过计算空间常数值来量化间隙液络部示踪剂耦合的程度，如此处所示的三种实验条件。切割加载技术也可用于研究视网膜中其他细胞类型和其他物种之间的电突触。

例如，这两个图表明，兔、A 型和 B 型水平细胞在暗适应条件下表现出同源示踪剂偶联，跟随、切割加载和神经生物素扩散。我们使用切割加载技术来研究示踪剂在白天和黑夜通过杆和锥体之间的间隙连接扩散的程度。此外，该技术可用于确定其他视网膜神经元之间的示踪剂耦合是否受视网膜时钟和/或特定的明暗条件控制。

它还可用于研究其他大脑区域神经元之间的示踪剂偶联。