Name: 扩展人外周血γδT细胞使用Zoledronate (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: 学习使用唑来膦酸和白介素-2从外周血单个核细胞大规模扩增γδT细胞的方法。该技术通过密度梯度离心分离细胞，培养14天后可获得高纯度CD3阳性Vγ9阳性细胞，适用于癌症免疫治疗的临床应用。

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1. 外周血单个核细胞的分离
<ol>
	<li>将血液（7.5–8.0 ml）吸入含肝素钠的 BD Vacutainer CPT 细胞分离管中。该管内含有肝素钠抗凝剂和 Ficoll-Hypaque 密度液，以及一个聚酯凝胶屏障，可将两种液体分隔开。将试管/血液样本在室温（18°C 至 25°C）下，使用水平转子（摆动吊篮）以 1800 × g 离心 20 分钟。关闭离心机刹车。</li>
	<li>离心后，从上至下各层依次为：a) 血浆 — b) 外周血单个核细胞（PBMC）和血小板 — c) 密度液 — d) 聚酯凝胶 — e) 粒细胞 — f) 红细胞（图 1）。</li>
	<li>收集部分血浆层，保留 5 至 10 mm 的血浆在界面层上方，避免扰动细胞层。该血浆可用于后续培养（第 2.5 节）。</li>
	<li>用移液器在界面处收集富集的组分（PBMC），并转移至 15 ml 锥形管中。</li>
	<li>用 10 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤 PBMC，将试管轻柔颠倒 5 次混匀，然后以 400 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>重复洗涤步骤两次，然后将细胞沉淀重悬于 5 ml PBS 中。测定细胞数量。通常每 1 ml 全血可回收约 1.3 × 106 个细胞。</li>
	<li>通过流式细胞术测定 PBMC 中 γδ T 细胞的频率和表型（第 3 节）（图 2）。</li>
</ol>
2. γδ T 细胞的扩增
<ol>
	<li>将细胞悬液置于15 ml锥形管中，在室温下以400 × g 离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>通过向培养基中加入人IL-2（IL-2）和唑来膦酸（Zometa），配制终浓度分别为1000 IU/ml和5 μM的培养基（CM）。ALyS203（Cell Science &amp; Technology Institute）或OpTmizer（Invitrogen）培养基均适用于γδ T细胞的良好扩增（更多详细信息见参考文献6和9）。Zometa以液体形式提供（4 mg/5 ml小瓶）。配制5 μM溶液时，将50 μl Zometa加入30 ml培养基中。</li>
	<li>用培养基重悬细胞沉淀，并调整细胞密度至1×106 个细胞/ml。</li>
	<li>将含1×106 个细胞的1 ml培养基加入24孔板的每孔中。对于大规模培养，可根据培养板、培养皿或培养瓶孔的表面积，按0.5 × 106 个细胞/cm2 的密度接种细胞。</li>
	<li>加入自体血浆（第1.3节）、混合人AB血清或胎牛血清（FCS），使其体积约占培养体系总体积的10%（24孔板每孔100 μl）。将培养板置于37°C、5% CO2 的加湿培养箱中培养24–48小时。</li>
	<li>维持细胞密度在0.5–2 × 106 个细胞/ml。每2–3天仅补充含人IL-2（1000 IU/ml）的新鲜培养基（不含Zometa），并根据细胞增殖程度，将培养细胞转移至新的孔或培养瓶中（图3）。向培养基中补充血浆或血清，使血清终浓度至少维持在1%。</li>
	<li>在第12–14天收获细胞，并通过流式细胞术分析γδ T细胞的频率、表型和功能（见下文）。</li>
</ol>
3. 通过流式细胞术进行表型分析
<ol>
	<li>将含有 2 x 105 个细胞的 200 μl 样品转移至荧光激活细胞分选（FACS）管中。</li>
	<li>加入 2 ml 冷 PBS，于 400 x g 离心 5 分钟。然后将沉淀重悬于 50 μl FACS 缓冲液（PBS + 1% FCS + 0.1% 叠氮化钠）中。向各样品中加入 5 μl 每种抗体（单克隆抗体列于表 1中）。</li>
	<li>冰上避光孵育 20 分钟。</li>
	<li>向每个样品中加入 2 ml FACS 缓冲液，然后涡旋混匀。于 4°C、400 x g 离心 5 分钟。小心弃去上清液。</li>
	<li>将细胞重悬于 300 μl FACS 缓冲液中并涡旋混匀。使用流式细胞仪分析样品（图 2）。</li>
</ol>
4. 干扰素-γ 产生检测10
<ol>
	<li>实验前一天，将 Daudi 细胞以每毫升 3-5 × 105 个细胞的密度接种于含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培养基（以下简称 RPMI-10）中，并加入 Zometa（5 μM），于 37°C 培养过夜，制备刺激细胞（以下称为 Z-Daudi）。</li>
	<li>收集 Z-Daudi 细胞，用 RPMI-10 培养基重悬至浓度为 2 × 106 个细胞/ml。向每孔圆底 96 孔板中加入 100 μl Z-Daudi 细胞悬液（含 2 × 105 个细胞）。</li>
	<li>将 γδ T 细胞用含 20 μg/ml 布雷菲德菌素 A 的 RPMI-10 培养基调整至浓度为 2 × 106 个细胞/ml。向每孔含 Z-Daudi 细胞的孔中加入 100 μl γδ T 细胞悬液（含 2 × 105 个细胞），或向对照孔中加入 100 μl RPMI-10 培养基（仅培养基对照），或加入含 20 ng/ml 佛波酯-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯 [PMA] 和 2 μg/ml 离子霉素的 RPMI-10 培养基。</li>
	<li>用移液器反复吹打数次混匀。于 37°C、5% CO2 培养箱中孵育 4 小时。</li>
	<li>将 96 孔板在 4°C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟，弃上清，用 200 μl 冷 PBS 重悬细胞沉淀。</li>
	<li>将细胞转移至流式管中，每管加入 4 ml 冷 PBS，于 4°C 以 400 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>用 50 μl FACS 缓冲液重悬细胞沉淀，加入 5 μl FITC 标记的抗 TCRVγ9 抗体和 2.5 μl PE/Cy5 标记的抗 CD3 单克隆抗体。避光室温孵育 15 分钟。</li>
	<li>每管加入 100 μl IntraPrep 试剂 1，室温孵育 15 分钟。每管加入 4 ml PBS，室温下以 400 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>吸除上清，每管加入 100 μl IntraPrep 试剂 2，室温避光孵育 5 分钟，期间不振荡。</li>
	<li>向检测管中加入 5 μl PE 标记的抗 IFN-γ 单克隆抗体，避光室温孵育 15 分钟。</li>
	<li>每管加入 4 ml PBS，室温下以 400 × g 离心 5 分钟。吸除上清，用 0.5 ml FACS 缓冲液重悬细胞沉淀。</li>
	<li>用流式细胞仪分析细胞样本。设门于 CD3+ TCRVγ9+ 细胞群，检测 IFN-γ 的表达情况（图 4）。</li>
</ol>
5. 代表性结果：
在培养开始时确定 PBMC 中 γδ T 细胞的比例非常重要。如图 2 A所示，第 0 天 PBMC 中 CD3+TCRVγ9+ γδ T 细胞的比例为 1.6%。主要细胞群体为 CD27+CD45RA+ 初始型或 CD27+CD45RA- 中心记忆型表型。当 γδ T 细胞被有效刺激后，通常在第 3 至第 5 天形成细胞簇（图 3 A 和 B）。若细胞簇形成延迟，则其他细胞类型（如 CD4+ 或 CD8+ αβ T 细胞或 NK 细胞）的生长可能占据主导，抑制 γδ T 细胞的扩增（图 3 C 和 D）。经过 14 天培养后，在成功的 γδ T 细胞培养中，γδ T 细胞在总培养细胞中的比例增至 93.8% 以上（图 2 E）。培养后的 γδ T 细胞上调了 NKG2D 和 CD69 的表达（图 2 G 和 H），并表现为 CD27-CD45RA- 效应记忆型表型（图 2 F）。通过检测细胞因子分泌和细胞毒性功能来评估 γδ T 细胞的功能。细胞内 IFN-γ 染色显示，γδ T 细胞在 PMA/离子霉素刺激或经唑来膦酸处理后积累 IPP 的 Z-Daudi 细胞刺激下，均可产生 IFN-γ（图 4）。这些结果表明，唑来膦酸可有效刺激并扩增具有功能活性的 γδ T 细胞。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>试管</td>
			<td>FITC</td>
			<td>PE</td>
			<td>ECD</td>
			<td>PE/Cy5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>CD3</td>
			<td>CD19</td>
			<td>CD45</td>
			<td>CD14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>CD3</td>
			<td>TCRαβ</td>
			<td>CD4</td>
			<td>CD8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>CD3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CD56</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>TCR Vγ9</td>
			<td>TCRαβ</td>
			<td>CD45</td>
			<td>CD3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>TCR Vγ9</td>
			<td>NKG2D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>TCR Vγ9</td>
			<td>CD69</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>TCR Vγ9</td>
			<td>mouse IgG1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>TCR Vγ9</td>
			<td></td>
			<td>CD45RA</td>
			<td>CD27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>TCR Vγ9</td>
			<td></td>
			<td>mouse IgG1</td>
			<td>mouse IgG1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 用于γδ T细胞多色染色的单克隆抗体。本实验室进行的γδ T细胞表型分析示例见图2。
<img alt="离心管中基于密度梯度的血浆分离示意图；显示 PBMC 层及血细胞。" src="/files/ftp_upload/3182/3182fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 外周血单个核细胞（PBMC）的分离。采集 7.5–8.0 ml 血液至含肝素钠的 BD Vacutainer CPT 细胞分离管中，并立即以 1800 × g 离心 20 分钟。离心后，自上而下可见如下分层：a) 血浆 — b) 单个核细胞（PBMC）和血小板 — c) 密度溶液 — d) 聚酯凝胶 — e) 粒细胞 — f) 红细胞。
<img alt="流式细胞术分析；TCR Vγ9、CD3表达；CD45RA、CD27评估；NKG2D、CD69直方图。" src="/files/ftp_upload/3182/3182fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. γδ T细胞典型的表面表型。外周血单个核细胞（PBMC）经唑来膦酸和IL-2刺激培养14天。细胞用FITC标记的抗TCR Vγ9抗体和PE/Cy5标记的抗CD3抗体染色，以监测γδ T细胞的扩增情况（A和E）。通过TCRVγ9的表达鉴定γδ T细胞，并检测其CD27和CD45RA（B和F）、NKG2D（C和G）或CD69（D和H）的表达情况。
<img alt="显微镜下的细胞培养阶段；延时图像序列中的生长进程。" src="/files/ftp_upload/3182/3182fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 代表性γδ T细胞培养结果。PBMC用IL-2（1000 IU/ml）和唑来膦酸（5 μM）刺激。图中显示代表性视野（IX71倒置显微镜[Olympus]，200倍）。在γδ T细胞成功扩增的第3天（A）和第5天（B），可观察到γδ T细胞的簇状聚集体。相比之下，在γδ T细胞生长不充分的情况下，则未观察到簇状或聚集体（C和D）。
<img alt="流式细胞术图示；TCR Vγ9 与 IFN-γ 表达；PMA/离子霉素、Z-Daudi 细胞激活。" src="/files/ftp_upload/3182/3182fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4. IFN-γ 的产生。γδ T 细胞分别仅与 RPMI-10（A）、PMA/离子霉素（B）或 Z-Daudi（C）共孵育 4 小时。首先对 TCRVγ9 的表面表达进行染色，随后通过细胞内 IFN-γ 染色检测 IFN-γ 的产生情况。
<img alt="细胞培养生长曲线；培养天数对应的γδT细胞百分比和数量；数据分析图表。" src="/files/ftp_upload/3182/3182fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 5"> 
图5. γδ T细胞培养的动力学。(A) 培养细胞的绝对数量，(B) γδ T细胞的百分比，以及(C) 指定时间点γδ T细胞的绝对数量。

<ol><li>Bonneville, M., O'Brien, R. L., Born, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3+T+cell+effector+functions%3A+a+blend+of+innate+programming+and+acquired+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">γ T cell effector functions: a blend of innate programming and acquired plasticity.</a> Nat Rev Immunol. 10, 467-478 (2010).</li>
<li>Hintz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+%28E%29-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl+pyrophosphate+as+a+major+activator+for+human+%CE%B3%CE%B4+T+cells+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification of (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate as a major activator for human γδ T cells in Escherichia coli.</a> FEBS Lett. 509, 317-322 (2001).</li>
<li>Gober, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+T+cell+receptor+%CE%B3%CE%B4+cells+recognize+endogenous+mevalonate+metabolites+in+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Human T cell receptor γδ cells recognize endogenous mevalonate metabolites in tumor cells.</a> J Exp Med. 197, 163-168 (2003).</li>
<li>Kabelitz, D., Wesch, D., He, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+of+gammadelta+T+cells+in+tumor+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Perspectives of gammadelta T cells in tumor immunology.</a> Cancer Res. 67, 5-8 (2007).</li>
<li>Roelofs, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+blood+monocytes+are+responsible+for+gammadelta+T+cell+activation+induced+by+zoledronic+acid+through+accumulation+of+IPP%2FDMAPP%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Peripheral blood monocytes are responsible for gammadelta T cell activation induced by zoledronic acid through accumulation of IPP/DMAPP.</a> Br J Haematol. 144, 245-250 (2009).</li>
<li>Dieli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+%CE%B3%CE%B4+T-lymphocyte+effector+functions+by+bisphosphonate+zoledronic+acid+in+cancer+patients+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Induction of γδ T-lymphocyte effector functions by bisphosphonate zoledronic acid in cancer patients in vivo.</a> Blood. 102, 2310-2311 (2003).</li>
<li>Kondo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zoledronate+facilitates+large-scale+ex+vivo+expansion+of+functional+%CE%B3%CE%B4+T+cells+from+cancer+patients+for+use+in+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Zoledronate facilitates large-scale ex vivo expansion of functional γδ T cells from cancer patients for use in adoptive immunotherapy.</a> Cytotherapy. 10, 842-856 (2008).</li>
<li>Espinosa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+and+biological+activity+of+bromohydrin+pyrophosphate%2C+a+potent+stimulator+of+human+%CE%B3%CE%B4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis and biological activity of bromohydrin pyrophosphate, a potent stimulator of human γδ T cells.</a> J Biol Chem. 276, 18337-18344 (2001).</li>
<li>Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+profile+and+anti-tumor+effects+of+adoptive+immunotherapy+using+%CE%B3%CE%B4+T+cells+against+advanced+renal+cell+carcinoma%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">Safety profile and anti-tumor effects of adoptive immunotherapy using γδ T cells against advanced renal cell carcinoma: a pilot study.</a> Cancer Immunol Immunother. 56, 469-476 (2007).</li>
<li>Murali-Krishna, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+antigen-specific+CD8+T+cells%3A+a+reevaluation+of+bystander+activation+during+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection.</a> Immunity. 8, 177-187 (1998).</li>
<li>Sato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+culture+medium+on+the+expansion+of+T+cells+for+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Impact of culture medium on the expansion of T cells for immunotherapy.</a> Cytotherapy. 11, 936-946 (2009).</li>
<li>Abe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+immunological+evaluation+of+zoledronate-activated+V%CE%B39+%CE%B3%CE%B4T-cell-based+immunotherapy+for+patients+with+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Clinical and immunological evaluation of zoledronate-activated Vγ9 γδT-cell-based immunotherapy for patients with multiple myeloma.</a> Exp Hematol. 37, 956-968 (2009).</li>
<li>Nakajima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I+study+of+adoptive+immunotherapy+for+recurrent+non-small-cell+lung+cancer+patients+with+autologous+%CE%B3%CE%B4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cardiothorac+Surg%22%5BJournal%5D)">A phase I study of adoptive immunotherapy for recurrent non-small-cell lung cancer patients with autologous γδ T cells.</a> Eur J Cardiothorac Surg. 37, 1191-1197 (2010).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本文介绍的方法能够高效地从外周血单个核细胞（PBMC）中扩增γδ T细胞。通过唑来膦酸和IL-2激活并扩增的γδ T细胞可发育出完整的效应功能，表现为细胞因子的产生和细胞毒性。已有报道称，合成磷酸化抗原溴羟基焦磷酸（BrHPP）和2-甲基-3-丁烯基-1-焦磷酸（2M3B1PP）也可扩增γδ T细胞；然而，这些试剂尚未商业化供应。相比之下，唑来膦酸已获批用于临床，商品名为Zometa。因此，该试剂易于获得且可靠。
培养基和血清的选择至关重要。应使用适当的培养基，如ALyS203（Cell Science &amp; Technology Institute）或OpTmizer（Invitrogen），以成功扩增γδ T细胞。11 需确认自体血浆、混合人AB血清或胎牛血清（FCS）能够支持γδ T细胞的培养。还需注意，某些供体的外周血单个核细胞（PBMC）对唑来膦酸刺激无反应，无论其他培养试剂如何。若出现此情况，唯一的选择是更换供体。
如我们所展示的，γδ T 细胞在相对较早阶段即实现富集；培养至第 7 天...

<table><tbody><tr><td>ZOMETA</td><td>诺华公司</td><td></td><td>唑来膦酸</td></tr><tr><td>PROLEUKIN</td><td>诺华公司</td><td></td><td>人重组IL-2</td></tr><tr><td>BD Vacutainer CPT 细胞分离管（含肝素钠）</td><td>BD 生物科学</td><td>362753</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Invitrogen</td><td>21870-076</td><td></td></tr><tr><td>ALyS203- 培养基</td><td>细胞科学 &amp;科技研究所</td><td>0301-7</td><td></td></tr><tr><td>OpTmizer</td><td>Invitrogen</td><td>0080022SA</td><td></td></tr><tr><td>布雷菲德菌素A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5936-200UL</td><td></td></tr><tr><td>佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585-1MG</td><td></td></tr><tr><td>ionomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13909-1ML</td><td></td></tr><tr><td>IntraPrep</td><td>贝克曼库尔特公司</td><td>A07803</td><td></td></tr><tr><td>抗人CD3-FITC或PE/Cy5</td><td>贝克曼库尔特公司</td><td>A07746 FITC A07749 PE/Cy5</td><td></td></tr><tr><td>抗人CD4-ECD</td><td>贝克曼库尔特公司</td><td>6604727</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD8-PE/Cy5</td><td>贝克曼库尔特有限公司</td><td>6607011</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD14-PE/Cy5</td><td>贝克曼库尔特公司</td><td>A07765</td><td></td></tr><tr><td>抗人CD19-PE</td><td>贝克曼库尔特公司</td><td>A07769</td><td></td></tr><tr><td>抗人CD45-ECD</td><td>贝克曼库尔特公司</td><td>A07784</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD56-PE/Cy5</td><td>贝克曼库尔特有限公司</td><td>A07789</td><td></td></tr><tr><td>抗人TCR&amp;alpha;&amp;#946;-PE</td><td>贝克曼库尔特公司</td><td>A39499</td><td></td></tr><tr><td>抗人 TCR V&amp;#947;9-FITC</td><td>贝克曼库尔特公司</td><td>IM1463</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD27-PE/Cy5</td><td>贝克曼库尔特公司</td><td>6607107</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD45RA-ECD</td><td>贝克曼库尔特公司</td><td>IM2711</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD69-PE</td><td>BD 生物科学</td><td>555531</td><td></td></tr><tr><td>抗人 NKG2D-PE</td><td>贝克曼库尔特公司</td><td>A08934</td><td></td></tr><tr><td>抗人干扰素&amp;#947;-PE</td><td>贝克曼库尔特公司</td><td>IM2717U</td><td></td></tr><tr><td>小鼠IgG1同型对照-PE</td><td>贝克曼库尔特公司</td><td>A07796</td><td></td></tr><tr><td>小鼠IgG1同型对照-ECD或PE/Cy5</td><td>贝克曼库尔特公司</td><td>A07797A07798</td><td></td></tr></tbody></table>

使用唑来膦酸扩增人外周血 γδ t 细胞

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

人类γδ T细胞能够识别并响应多种应激诱导的抗原，从而产生广泛的先天性抗肿瘤和抗感染活性。1 外周血中大多数γδ T细胞表达Vγ9Vδ2 T细胞受体。这些细胞以主要组织相容性复合物非依赖的方式识别抗原，并发展出强烈的细胞溶解活性和类似Th1的效应功能。1 因此，γδ T细胞是癌症免疫治疗中极具吸引力的效应细胞候选者。Vγ9Vδ2 T细胞可响应磷酸化抗原，例如由细菌通过异戊烯基生物合成途径产生的(E)-4-羟基-3-甲基-2-丁烯基焦磷酸（HMBPP）2，以及真核细胞通过甲羟戊酸途径产生的异戊烯基焦磷酸（IPP）3。在生理条件下，非转化细胞中产生的IPP不足以激活γδ T细胞。肿瘤细胞中甲羟戊酸途径的失调导致IPP积累，从而激活γδ T细胞。3 由于氨基双膦酸盐（如帕米膦酸盐或唑来膦酸盐）可抑制甲羟戊酸途径中位于IPP下游的酶——法尼基焦磷酸合酶（FPPS），因此可通过氨基双膦酸盐治疗性地提高细胞内IPP水平以及对γδ T细胞识别的敏感性。在药理学相关浓度下，非转化细胞中IPP的积累效率低于肿瘤细胞，这使得我们能够利用氨基双膦酸盐激活γδ T细胞进行癌症免疫治疗。4 有趣的是，当外周血单个核细胞（PBMC）用氨基双膦酸盐处理时，单核细胞因高效摄取药物而导致IPP积累。5 积累IPP的单核细胞转变为抗原呈递细胞，进而刺激外周血中的Vγ9Vδ2 T细胞。6 基于上述机制，我们开发了一种利用唑来膦酸和白细胞介素-2（IL-2）大规模扩增γδ T细胞培养物的技术。7 其他扩增γδ T细胞的方法则使用合成的磷酸化抗原，如溴羟基焦磷酸（BrHPP）8 或2-甲基-3-丁烯基-1-焦磷酸（2M3B1PP）9。所有这些方法均可实现体外扩增，获得大量可用于过继性免疫治疗的γδ T细胞。然而，只有唑来膦酸是经美国食品药品监督管理局（FDA）批准且可商业获得的试剂。经唑来膦酸扩增的γδ T细胞表现出CD27-CD45RA-效应记忆表型，其功能可通过干扰素-γ（IFN-γ）产生实验进行评估。7

本文介绍了一种从外周血单个核细胞（PBMC）中扩增γδ T细胞的方法。通过唑来膦酸和白细胞介素-2（IL-2）刺激并扩增PBMC来源的γδ T细胞。大规模扩增的γδ T细胞可用于癌症的自体细胞免疫治疗。

使用唑来膦酸扩增人外周血 γδ T 细胞

人类 γδ T 细胞能够识别并响应多种应激诱导的抗原，从而产生先天性的广谱抗肿瘤和……

本视频展示了利用唑来膦酸进行人外周血γδ T细胞的大规模扩增。首先，对全血进行密度梯度离心，以分离外周血单个核细胞（PBMCs）。随后，使用唑来膦酸刺激PBMCs，使单核细胞转化为抗原呈递细胞，同时加入IL-2以刺激γδ T细胞。细胞培养最多14天，以扩增γδ T细胞。通过流式细胞术进行培养物分析表明，收获的大部分细胞呈现CD3阳性、Vγ9阳性表型。该技术相较于现有方法的主要优势在于，所用试剂（ate）已获准用于临床应用中的Zometa。因此，一种可靠的试剂可轻松用于临床级γδ T细胞制备，表明该操作流程将由康渡诚（Makoto Condo）和泉亚美（Amichi Izumi）的细胞培养方法进行。本实验室的技术人员首先使用含有肝素钠抗凝剂的BD Vacutainer CPT细胞制备管收集全血，该管内还含有高密度峰状液体及聚酯凝胶屏障，可分离两种液体。将样本在室温下以水平摆动转子离心20分钟，离心力为1800 × g。离心结束后，管内内容物将分为五层。最上层的黄色部分为血浆。其下方的乳白色层含有外周血单核细胞和血小板，位于浅黄色密度溶液的上方。白色的聚酯凝胶层将此层与颗粒层分隔开，颗粒层呈灰白色，位于试管底部红细胞层的上方。使用一支2毫升的移液器，小心地吸取部分血浆层，保留界面以上5到10毫米的血浆，并将其转移至一个15毫升的锥形管中。将该管置于4摄氏度环境中，用于后续培养。接着，使用2毫升移液器从界面处收集富含PBMC的组分，并将其转移至另一个15毫升的锥形管中。为洗涤外周血单个核细胞（PBMC），加入10毫升磷酸盐缓冲液（PBS），并将离心管轻轻颠倒五次。随后以400 × g离心5分钟。重复洗涤步骤两次。然后将细胞重悬于5毫升PBS中，使用血细胞计数板测定细胞数量。通常，从一毫升全血中可回收 1.3 × 10⁶ 个细胞。取含有 1 × 10⁶ 个细胞的 PBMC 部分，置于冰上保存，用于流式细胞术分析。为了扩增外周血单个核细胞（PBMC）样本中的γδ T细胞，将细胞悬液置于15毫升锥形管中，在室温下以400 × g离心5分钟。离心后，弃去上清液，并将细胞重悬于细胞培养基中，培养基中添加1000 IU/mL的IL-2和5微摩尔的唑来膦酸，细胞密度为1 × 10⁶个细胞/毫升。唑来膦酸可抑制单核细胞中的法尼基焦磷酸合酶，导致异戊烯基焦磷酸积累，并促使单核细胞转化为抗原呈递细胞。接下来用移液器将含有1×10⁶个细胞的1毫升培养基加入24孔板的每个孔中。细胞密度应为每平方厘米0.5×10⁶个细胞。因此，对于较大规模的培养，需按比例调整，以适配24孔板的每个孔。加入先前收集的100微升自体血浆、混合人AB型血清或胎牛血清。将培养板置于湿润的37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中，每两至三天更换一次培养液，换用新鲜的、添加了人源IL-2（每毫升1000 IU）的含血清培养基。当细胞密度达到每毫升0.5至2×10⁶个细胞时，将细胞以1:2的比例传代至新的孔板或培养瓶中。在数天内观察细胞生长情况。图中显示的是第0天的细胞状态。较小的细胞为淋巴细胞，较大的细胞为单核细胞。约24小时后，单核细胞会贴附在孔板底部。培养两天后，部分淋巴细胞会附着于单核细胞；三天时，γδ T 细胞开始形成细胞簇；五天时，可观察到较大的细胞簇。相比之下，若 γδ T 细胞增殖不足，则不会观察到细胞簇或聚集体。当细胞簇形成延迟时。如图所示，其他细胞类型（如 CD4 阳性或 CD8 阳性的 αβ T 细胞或 NK 细胞）的生长会抑制 γδ T 细胞的增殖。在第 12 至 14 天，用 10 毫升移液管充分吹打细胞，并将细胞收集至 50 毫升离心管中。此时可对细胞进行流式细胞术分析，以确定 γδ T 细胞的频率、表型及功能。为进行 PBMC 或扩增的 γδ T 细胞的表型分析，首先将含有 2 × 10⁵ 个细胞的 200 微升样本分别转移至九个荧光激活细胞分选管中。加入 2 毫升预冷的 PBS，以 400 × g 离心 5 分钟，然后将沉淀重悬于 50 微升 FACS 缓冲液中。向各样本中加入 5 微升所需的各种抗体。将样品置于冰上避光孵育 20 分钟。孵育结束后，向每个样品中加入 2 毫升 fax 缓冲液，然后在 4°C、400 × g 条件下涡旋离心 5 分钟。离心后，小心弃去上清液，将细胞重悬于 300 微升 fax 缓冲液中，并涡旋混匀。然后使用流式细胞仪分析样品，以评估γδ T细胞的功能。通过细胞内干扰素γ染色分析其产生干扰素γ的能力。将γδ T细胞重悬于含20 µg/mL佛波醇脂（Felden A）的RPMI 10培养基中，细胞浓度为2 × 10⁶ 个细胞/mL。Felden A 抑制干扰素 γ 的分泌，导致干扰素 γ 在细胞内积聚。接下来，将 100 微升 γδ T 细胞悬液转移至 96 孔板的每个孔中，每孔含有 100 微升仅 RPMI 10 培养基，或含有 20 纳克/毫升佛波醇 12-乙酸酯 13-乙酸酯（PMA）加 2 微克/毫升离子霉素（ionomycin）的 RPMI 10 培养基，或 Z duddy 细胞。用移液器上下吹打数次混匀。在37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中孵育4小时。随后在4摄氏度下以400 × g离心5分钟，重悬沉淀于200微升预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中。将样品转移至流式管中。然后加入4 mL冷的PBS，于4 °C、400 ×g离心5分钟。离心后，用50 µL流式缓冲液重悬沉淀，并加入5 µL。加入荧光素（FE）标记的抗TCRVγ9单克隆抗体和2.5微升PE标记的抗CD3单克隆抗体，避光室温孵育15分钟。孵育结束后，每管加入100微升内染试剂一（intra prep reagent one），室温孵育15分钟。随后每管加入4毫升PBS，室温下以400 × g离心5分钟。离心后，弃上清，将沉淀重悬于100微升内染试剂二（intra prep reagent two）中，室温孵育5分钟。在室温下，向试管中加入5 µL PE标记的抗干扰素γ单克隆抗体。避光孵育15分钟。在室温下，向每根试管中加入4 mL PBS，并在400 × g下离心5分钟。在室温下，通过抽吸去除上清液，并重悬细胞沉淀。在 0.5 毫升 fax 缓冲液中。通过流式细胞仪对细胞进行分析，设门于 CD3 阳性 TCR Vγ9 阳性细胞，并检测干扰素 γ 的表达。此处所示为 γδ T 细胞典型的表面表型。在第0天，通过CD3和TCRVγ9的表达来鉴定γδ T细胞。外周血单个核细胞（PBMC）中CD3阳性且TCRVγ9阳性的γδ T细胞比例为1.6%。γδ T细胞的主要群体表现为CD27阳性、CD45RA阳性的初始表型，或CD27阳性、CD45RA阴性的中央记忆表型。CD27和CD45RA的表达用于确定其初始或记忆表型。CD27 阳性。CD45. RA 阳性为初始型。CD 27 阳性。CD 45 RA 阴性为中央记忆型 CD 27 阴性。CD 45。RA 阴性为效应记忆细胞。CD27 阴性。CD45。RA阳性为终末分化的表型。细胞的活化状态通过NK G 2D或CD 69进行分析，如图所示。γδ T细胞表达NK G 2D，但不表达CD 69。培养14天后，γδ T细胞在培养细胞中的比例增加至93.8%以上。在成功的γδ T细胞培养中，这些细胞表现为CD27阴性、CD45RA阴性的效应记忆表型。培养的γδ T细胞上调了NKG2D和CD69的表达。 细胞内干扰素γ染色显示，γδ T细胞在PMA CIN处理或与积累IPP的Z dwy细胞共培养后可产生干扰素γ。经唑来膦酸处理后，分别有97%和19.6%的γδ T细胞在PMA CIN和Z ddy细胞刺激下产生干扰素γ。这些结果表明，唑来膦酸能够有效刺激并扩增具有功能活性的γδ T细胞。经唑来膦酸和IL-2扩增的γδ T细胞培养动力学显示，培养细胞的绝对数量在12至14天内呈指数增长。γδ T细胞的富集较早实现，至第7天时，培养细胞中γδ T细胞比例接近80%。在指定时间点的γδ T细胞绝对数量表明，从含有1.6×10⁴个γδ T细胞的1×10⁶个PPMC起始，可获得约2.2×10⁸个γδ T细胞。该技术为癌症免疫治疗领域的研究人员探索多种不同类型癌症的临床应用铺平了道路。这种培养方法已用于一期临床试验，以评估供体扩增的γδ T细胞转移疗法在癌症患者中的安全性和可行性。

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