Name: 分离的CD133 +肝干细胞的克隆扩增 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: 了解从小鼠肝脏分离CD133阳性肝干细胞并进行克隆扩增的方法。该技术通过流式细胞术实现单细胞分离，支持干细胞功能分析与分化研究，为肝脏再生和癌症研究提供重要工具。

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Rountree 博士感谢儿童奇迹网络、美国国立卫生研究院（NIH）K08DK080928 和 R03DK088013 项目以及美国癌症协会研究学者奖（MGO-11651）提供的当前资助。Rountree 博士指出，本实验方案最初是在儿科科学家发展计划（NICHD 资助项目 K12-HD00850）的资助下开发并优化的。

所有溶液、培养基、仪器、滤器和试管均应无菌，并采用无菌操作技术处理，以降低污染风险。所有缓冲液和培养基需提前24小时配制，并于4°C保存。
1. 从完整肝脏中分离实质和非实质部分
<ol>
<li>使用带螺口盖的15 cc离心管，在10 ml无菌PBS中配制消化用酶溶液，其中包含5 mg胶原酶、5 mg蛋白酶和1 mg DNA酶。</li>
<li>采用机构批准的（机构动物护理与使用委员会）方法处死小鼠，例如CO2窒息法。用70%乙醇溶液擦拭已处死动物的腹部区域。使用无菌器械打开腹腔，整块取出肝脏。从取出的肝脏上移除胆囊。将完整肝脏转移至生物安全柜内的密闭无菌培养皿中。</li>
<li>该操作在生物安全柜中进行。使用无菌剃刀片，在无菌培养皿中对肝脏组织进行多方向的横切与纵切，持续切碎约1分钟。取四分之一的切碎肝组织放入含有10 cc PBS（含步骤1.1中所述胶原酶、蛋白酶和DNA酶）的15 cc离心管中。对每个四分之一的切碎肝组织重复此操作。</li>
<li>将含有四分之一切碎肝组织及酶溶液的离心管置于37°C水浴中，以1-2个循环/秒的频率震荡消化45分钟。从水浴取出后，用70%乙醇擦拭管壁，再转移至生物安全柜中。</li>
<li>该操作在生物安全柜中进行。将消化后的肝组织悬液通过70微米孔径的细胞滤网过滤至无菌培养皿中。使用含10%热灭活胎牛血清的DMEM:F12培养基，每次2 ml，冲洗滤网，并用注射器活塞的橡胶端将残留的消化组织压过滤网。重复此冲洗操作5次，使滤液体积总量约为20 mL。将滤液均分为两份，分别装入两个15 mL离心管中。</li>
<li>所有转移操作均应在生物安全柜中进行；若条件允许，使用4°C预冷的离心机。以50 × g离心1分钟，保留上清液#1，弃去实质细胞沉淀。将上清液#1再次以50 × g离心1分钟，保留上清液#2，弃去沉淀。将上清液#2再次以50 × g离心1分钟，保留上清液#3，弃去沉淀。最后将上清液#3以180 × g离心8分钟，获得非实质细胞组分。</li>
</ol>
2. 红细胞裂解
在层流罩中操作，保持细胞低温，并使用预冷至指定温度的溶液 4°C.

<ol>
<li>实验前一晚，通过将10倍浓度的BD Pharm Lyse缓冲液用无菌蒸馏水按1:10稀释，配制红细胞裂解缓冲液。1倍浓度的溶液应于4°C避光保存，可稳定保存30天。 4°C.</li>
<li>实验前一天晚上，使用无菌 PBS 和 0.5% 牛血清制备 Miltenyi 缓冲液 白蛋白，以及 2 mM EDTA。使用带有 0.45 微米滤膜的真空滤器装置过滤溶液。用原始塑料盖盖住倾斜装置顶部，并用塑料封口膜密封。将整个滤器装置于 4°C 静置12小时以去除EDTA中的气泡。12小时后，滤器单元可替换为标准无菌盖。</li>
<li>该操作在超净工作台内完成。使用一个5 ml无菌离心管，将步骤1.6中获得的非实质细胞沉淀用2.1中1×稀释的红细胞裂解缓冲液1 mL重新悬浮。盖上管盖，移出超净工作台。 </li>
<li>轻轻涡旋5秒，然后在15分钟内孵育于 4°C 避光</li>
<li>以 200 × g 离心 5 分钟。 </li>
<li>该操作在超净台中完成。弃去上清液中的裂解红细胞，将沉淀物重悬于 1 ml 冰冷且无菌的 Miltenyi 缓冲液中。 </li>
<li>200 × g 离心 5 分钟。</li>
<li>该操作在超净工作台中进行。弃去上清液，将沉淀物重悬于 1 ml 冰上预冷且无菌的 Miltenyi 缓冲液中。</li>
<li>移除 10 μl PBS细胞悬液并加入 10 μl 台盼蓝。使用血细胞计数板计数剩余的非实质细胞。</li>
</ol>
3. 非实质细胞组分中CD45造血细胞的去除
在超净工作台中操作，保持细胞低温，并使用冷却至4°C的溶液。
<ol>
<li>每 107 个细胞用 100 μL Miltenyi 缓冲液重悬，细胞总数最多可达 108 个。</li>
<li>每 107 个细胞加入 20 μL Miltenyi CD45 磁珠抗体，4°C 孵育 15 分钟。</li>
<li>加入额外的 2 mL Miltenyi 缓冲液，以 200 × g 离心 5 分钟。弃去上清液。将细胞沉淀（最多 108 个细胞）重悬于 1 mL Miltenyi 缓冲液中。</li>
<li>在超净工作台内，使用 Miltenyi LD 磁性柱过滤细胞。首先将磁性柱置于磁力架（Miltenyi MidiMACS 或 QuadroMACS）上，在滤柱下方放置无菌 5 mL 离心管以收集滤液。用加入 2 mL Miltenyi 缓冲液预处理磁性柱。</li>
<li>预洗步骤完成后，将细胞上样至 LD 柱。当细胞悬液进入柱内后，加入 1 mL Miltenyi 缓冲液，并重复此洗涤步骤 2 次。切勿使用随柱提供的推杆来加快过滤速度。仅当滤柱置于磁力架中时，才收集滤液。</li>
<li>将收集的约 5 mL 滤液（柱内残留约 1 mL）在 200 × g 离心 5 分钟，以收集 CD45 耗竭的非实质细胞。弃去柱内保留的 CD45 阳性细胞及磁性柱。</li>
</ol>
4. CD133阳性细胞的流式细胞术分离
<ol>
<li>制备卵圆细胞培养基。以1:1的DMEM:F12培养基添加10%热灭活胎牛血清作为基础，加入胰岛素（1 μg/ml）、HEPES（5 mol/L）和青霉素/链霉素（1%体积/体积）。使用带有0.45微米滤膜的真空过滤装置过滤溶液。</li>
<li>将细胞重悬于Miltenyi缓冲液中，每107个细胞使用100 μL缓冲液。每份样品中加入2 μL CD133-PE偶联抗体。另取一组细胞，加入IgG-PE偶联抗体作为对照。再保留第三组细胞不进行染色，作为流式细胞术（FACS）的未染色对照。</li>
<li>在4°C避光孵育15分钟。将细胞重悬于2 ml染色缓冲液中，以200 × g离心5分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于1 ml Miltenyi缓冲液中。</li>
<li>此步骤采用标准的流式细胞分选程序，具体操作可能因机构设备而异。利用未染色细胞和IgG-PE染色细胞调整分选参数，以优化CD133+细胞群的设门。PE（R-藻红蛋白）通常可在配备488 nm激发激光的任何流式细胞仪上使用。PE的发射峰为575 nm，通过FL-2通道检测。 
注意：使用BD FACS Calibur或BD FACS Vantage仪器并配合Cell Quest软件进行数据采集时，我们采用对数尺度的前向散射（Forward Scatter）和侧向散射（Side Scatter）图来识别细胞群，侧向散射设定为250；FL1和FL2通道均设为对数尺度，值设为550。这些参数为观察肝脏非实质细胞提供了初始参考设置，可根据阳性与阴性细胞群的染色强度进行相应调整。</li>
<li>利用CD133+设门分离CD133+细胞群，并将细胞收集至无菌过滤的细胞培养基中。</li>
</ol>
5. 细胞培养方法
<ol>
<li>将FACS收集的细胞在200 × g条件下离心5分钟。用卵圆细胞培养基重悬细胞沉淀，调整密度至约5000个细胞/mL。初始实验时可使用较高浓度（最高达50,000个细胞/mL），随着操作技术的熟练以及细胞存活率和收获率的提高，可逐步降低接种密度。</li>
<li>将细胞接种至BD Biocoat Laminin包被的96孔板，接种密度为1000个细胞/cm2。置于37°C、含5% CO2的加湿细胞培养箱中培养。24小时后，加入肝细胞生长因子（Hepatocyte Growth Factor，50 ng/mL）和表皮生长因子（Epidermal Growth Factor，20 ng/mL）。</li>
<li>对于单细胞培养，直接将单个细胞分选至Laminin包被的96孔板各孔中，每孔含50 μL卵圆细胞培养基。使用单细胞FACS分选设置，严格确保每孔仅有一个阳性细胞。24小时后，每孔加入50 μL含HGF和EGF的卵圆细胞培养基（成分同第5.2步）。每5–7天完全更换培养基。</li>
<li>当扩增的细胞克隆汇合度超过50%时（通常在接种后约2周发生，具体时间取决于接种细胞总数及细胞存活率），可按以下方法以1:3比例传代。</li>
<li>使用0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞进行传代。加入适量消化液覆盖孔底即可，96孔板每孔加50–100 μL。将板置于37°C培养箱中孵育3–5分钟。</li>
<li>每孔加入100 μL培养基终止消化，并将全部液体转移至5 mL离心管中。每管再加入1 mL培养基，于200 × g离心5分钟。</li>
<li>将细胞沉淀重悬后，接种至Laminin包被的培养皿中，将1个孔的细胞接种至3个新孔中（传代比例为1:3）。</li>
</ol>
6. 使用 RT-PCR 验证双潜能状态
该步骤详见于随 RNeasy 试剂盒提供的 RNeasy 操作手册中。
<ol>
<li>对96孔板中的菌落使用RNeasy微量柱。吸除每孔中的培养基。直接向每孔加入75 μl RNeasy试剂盒中的RLT缓冲液。用无菌橡胶刮刀刮取孔底细胞。用移液器将裂解液转移至微量离心管中，并涡旋混合1分钟。向裂解液中加入70%乙醇，并通过移液混匀。</li>
<li>将溶液转移至置于2 ml收集管中的RNeasy柱（RNeasy试剂盒提供），在微量离心机中以10,000 rpm离心15秒。弃去流出的滤液。</li>
<li>重复使用该收集管。向RNeasy柱中加入350 μL RW1缓冲液（RNeasy试剂盒提供），以10,000 rpm离心15秒，以洗涤柱膜。弃去洗涤液。</li>
<li>将10 μL DNase I储存液加入70 μL RDD缓冲液中（均来自RNeasy试剂盒）。将80 μL DNase I与RDD缓冲液的孵育混合液加至RNeasy柱膜上，在室温下孵育15分钟。</li>
<li>向RNeasy柱中加入350 μL RW1缓冲液（RNeasy试剂盒提供），以10,000 rpm离心15秒，以洗涤膜。弃去流出的洗涤液和收集管。</li>
<li>将RNeasy柱放入一个新的2 ml收集管中（RNeasy试剂盒提供）。向RNeasy柱中加入500 μL RPE缓冲液（RNeasy试剂盒提供），以10,000 rpm离心15秒，以洗涤膜。弃去流出的洗涤液。</li>
<li>使用无RNase水（RNeasy试剂盒提供）配制80%乙醇。向RNeasy柱中加入500 μL 80%乙醇，以10,000 rpm离心2分钟。弃去流出的洗涤液。</li>
<li>将RNeasy柱放入一个新的2 ml收集管中（RNeasy试剂盒提供），以最大转速离心5分钟。弃去任何残留的洗涤液和收集管。</li>
<li>将RNeasy柱放入一个新的1.5 ml收集管中（RNeasy试剂盒提供）。在柱膜中央加入14 μL无RNase水（RNeasy试剂盒提供），以最大转速离心1分钟。收集含有纯化RNA的滤液，若需立即合成cDNA则置于冰上，或于-80°C保存以备后续使用。</li>
<li>使用Omniscript进行逆转录。将RNase抑制剂用预冷的1x RT缓冲液稀释至终浓度为10单位/μL。涡旋5秒，短暂离心5秒。根据Omniscript操作手册第13页，在冰上新鲜配制主混合液。涡旋5秒，短暂离心5秒。建议配制的主混合液体积比所有反应所需总体积多10%。</li>
<li>将模板RNA加入含有主混合液的各个反应管中。涡旋5秒，短暂离心5秒。在37°C孵育60分钟。</li>
<li>使用HotStarTaq DNA聚合酶对肝细胞（Albumin）和胆管细胞特异性基因进行PCR扩增。根据HotStarTaq操作手册第15页配制反应混合液。建议将引物原液稀释至20 pm/μl，并在每个反应管中正向和反向引物各使用1 μL。根据最初用于RNA提取的细胞数量，建议将最终cDNA分至3个反应管中（β-actin作为上样对照，Albumin 和 KRT19）开始实验。</li>
<li>PCR引物设计见表1。</li>
<li>将反应管放入热循环仪中。建议初次实验采用以下程序：95°C预变性15分钟，1个循环；随后95°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸30秒，共35个循环；最后72°C终延伸10分钟。</li>
<li>使用含溴化乙锭的琼脂糖凝胶分析PCR产物。</li>
</ol>
7. CD133+ 干细胞成瘤潜能的验证
<ol>
<li>此步骤可使用第4步中 freshly isolated 的细胞，或使用第5步中培养的细胞进行。我们建议初始实验使用培养后的细胞，因为 freshly isolated 的细胞存活率较低，且产量较少。</li>
<li>使用上述第5.5步的0.05%胰蛋白酶-EDTA对细胞进行消化。在37°C孵育3-5分钟后，向每孔加入100 μL培养基，将每孔中的全部液体转移至各自的5 ml离心管中（1孔 = 1管）。每管再加入1 ml培养基，于200 × g离心5分钟。</li>
<li>将细胞重悬于1 ml预冷的PBS中。取10 μl PBS细胞悬液，加入10 μl台盼蓝。通过台盼蓝排斥法计数活细胞数量。若使用FACS分选的细胞，则细胞数量由FACS分选时的计数确定。</li>
<li>以200 × g离心5分钟，弃上清，将细胞重悬于PBS中，浓度为1 × 106 个活细胞/100 μl。加入100 μl Matrigel。使用28号针头将细胞悬液皮下注射至6周龄免疫缺陷裸鼠体内。每注射位点注射200 μl，含1 × 106 个细胞。</li>
<li>每日监测小鼠肿瘤生长情况。通常在接种后3-4周形成肿瘤，使用游标卡尺测量肿瘤体积（高度 × 长度 × 宽度）。</li>
</ol>
8. 代表性结果：
从小鼠正常的健康肝脏中，预期每只肝脏可获得的CD133+肝干细胞数量为1,000至5,000个。这类细胞在静息状态的肝脏中相对稀少，且在体外培养中增殖能力较差。我们不建议对正常肝脏进行单细胞分析，因其可扩增的活细胞得率极低。
对于具有显著慢性损伤的肝脏，例如采用含0.1% DDC的饮食处理6周1，或因基因修饰导致慢性损伤的模型，如MAT1a-/-或肝脏特异性Pten-/-小鼠2-4，所分离得到的细胞数量会增加，每只肝脏最多可分离出100,000个细胞（图2）。若使用基因工程模型，必须了解其自发性肿瘤的发生率，因为肝脏干细胞的分离操作应在无肿瘤动物中进行。例如，若MAT1a-/-模型在18个月时出现自发性肿瘤，则建议在15至16个月龄之前使用动物，以避免任何已报道的自发性肿瘤发生。
从慢性损伤模型中分离单个细胞，一旦掌握操作流程并确保细胞活力，每个96孔板可获得数个（3-9个）由单细胞扩增形成的细胞集落。图3展示了单个CD133+细胞培养7天后扩增出的细胞集落的代表性相差显微图像。
通过Albumin和Krt19的RT-PCR检测验证双潜能状态。由单细胞扩增形成的克隆集落将同时表达肝细胞标志物（Albumin）和胆管上皮细胞标志物（Krt19）。图4展示了三个分离克隆集落的双潜能表达情况，每个集落约含25个细胞，培养7天。
来自正常肝脏和化学诱导肝损伤（例如，0.1% DDC 饮食持续 6 周）的 CD133+ 干细胞在裸鼠中不会形成肿瘤。来自特定遗传模型（MAT1a-/- 或肝脏特异性 Pten-/- 小鼠）的 CD133+ 干细胞，若在晚期肿瘤前慢性损伤阶段晚期分离，则可在裸鼠中形成肿瘤。这种成瘤表型目前被认定为癌症干细胞2-4。例如，MAT1a-/- 小鼠在 18 周龄时会自发形成肝肿瘤。在肝病晚期慢性损伤阶段（15–16 周龄）分离的 CD133+ 肝干细胞，在裸鼠中可形成肿瘤。图 5 展示了由体外扩增的单个 CD133+ 肝干细胞（1 × 106 个细胞）双侧注射后形成的代表性肿瘤。
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>基因</td>
 <td>上游引物</td>
 <td>下游引物</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>β-Actin</td>
 <td>5'-TGTTACCAACTGGGACGACA-3'</td>
 <td>5'-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3'</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Albumin</td>
 <td>5'-CATGCCAAATTAGTGCAGGA-3'</td>
 <td>5'-GCTGGGGTTGTCATCTTTGT-3'</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Keratin 19</td>
 <td>5'-TGCTGGATGAGCTGACTCTG-3'</td>
 <td>5'-AATCCACCTCCACACTGACC-3'</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表1：RT-PCR引物设计
<img src="/files/ftp_upload/3183/3183fig1.jpg" alt="肝细胞分离流程图；磁性过滤、CD133-PE、FACS、克隆扩增。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 图 1：方法总体示意图。
<img src="/files/ftp_upload/3183/3183fig2.jpg" alt="流式细胞术散点图比较；MAT1a基因敲除型与对照组；FL-1荧光信号。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 图2：在高度富集的CD45阴性非实质细胞组分中鉴定出CD133+肝干细胞。 来自野生型小鼠的未损伤对照肝脏显示，在高度富集的CD45阴性非实质细胞组分中CD133+细胞占0.4%。在MAT1a-/-基因敲除模型（慢性肝损伤模型）中，同一高度富集组分内的CD133+细胞群体扩增了10倍或更多。
<img src="/files/ftp_upload/3183/3183fig3.jpg" alt="细胞生长相差显微镜图像，显示细胞形态和结构分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 图3：单个CD133+克隆扩增形成的菌落。 在层粘连蛋白包被的96孔板上由单个CD133+细胞扩增出的四个菌落的相差显微镜图像。
<img src="/files/ftp_upload/3183/3183fig4.jpg" alt="显示 Beta-Actin、Albumin 和 KRT-19 表达的蛋白质条带的凝胶电泳结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 图 4：CD133+ 肝干细胞单克隆扩增集落的双潜能基因表达。 第 7 天时，集落约含 25 个细胞。基因表达结果显示肝细胞标志物 Albumin 和胆管细胞标志物 Krt19 的表达，证实 CD133+ 细胞具有双潜能特性。
<img src="/files/ftp_upload/3183/3183fig5.jpg" alt="小鼠肿瘤生长比较，箭头指示皮下肿瘤部位，肿瘤学研究实验。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图5"> 图5：CD133+ 肝干细胞在裸鼠体内形成肿瘤。箭头指示来自MAT1a-/-模型的1×106个CD133+细胞注射后4周形成的肿瘤。来自毒素诱导的慢性肝损伤（如CCl4处理或0.1% DDC饮食）的CD133+细胞则不能形成肿瘤。肿瘤形成能力用于鉴定干细胞群体中的恶性潜能或癌症干细胞表型。

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</ol>

Rountree 博士获得拜耳制药公司的研究资助。丁博士、克罗克斯博士、Dang 女士和 VanKirk 女士无任何利益冲突需要披露。

与造血系统不同，在造血系统中，造血干细胞负责维持细胞分化系统，以替换白细胞、红细胞和血小板的正常生理性更新，而肝干细胞或成体肝前体细胞并不参与正常的肝脏稳态5,6。在急性肝损伤或部分肝切除后，作为已分化的肝上皮细胞，肝细胞会经历多轮增殖，以替代丢失的肝组织5,6。只有在慢性损伤情况下，才可观察到肝干细胞的增殖1,5-11。这些成体器官特异性干细胞被认为能够分化为肝细胞和胆管上皮细胞1,5-8。有趣的是，绝大多数肝癌发生在慢性损伤的基础上，因此肝干细胞也被假定为部分肝癌的前体细胞2-4,12-17
肝脏干细胞研究面临的主要挑战之一是从稀有细胞群体中分离出可用于功能分析的细胞。例如，肝脏中绝大多数细胞为肝细胞，其体积显著大于胆管细胞及其他较小的非实质细胞。通过将整个肝脏分解为不同的细胞组分（大的肝细胞——实质细胞组分和较小的细胞——非实质细胞组分），并进一步筛选CD45阴性细胞（非造血来源细胞），我们可将起始的干细胞群体富集600倍以上。1,18-21需要强调的是，我们绝非认为CD133+细胞群体是100%纯的干细胞群体，而显然代表了一类具有不同谱系来源和再增殖潜能的异质性细胞群体。该领域目前面临的主要局限之一在于干细胞与前体细胞的定义尚不明确。本研究中我们对“干细胞”一词的使用较为宽泛；但严格而言，CD133+非实质细胞属于双谱系前体细胞群体。鉴于当前肝脏干细胞与前体细胞研究的现状，本报告为对该领域感兴趣的科研人员提供了一个可行的起点。随着新标志物的出现，例如EpCAM22,23，或转录因子如Sox924，这些分子均可被整合到研究体系中。例如，我们已发现EpCAM+细胞与CD133+细胞之间存在较高的共表达率。
本报告中，我们详细描述了一种从小鼠正常肝脏以及慢性肝损伤模型中分离肝干细胞的方法，这些模型表现出肝干细胞增殖增加。该方法相较于对冷冻或福尔马林固定的肝脏组织进行常规免疫组织化学分析具有明显优势，因为分离后的活细胞可用于功能研究1,3,4。本方法的特定目标是分离出相对纯度较高的肝干细胞群体，以便在体外进行克隆扩增。
该方案的主要局限在于，经过流式细胞术分离后，大多数细胞将失去活性（参见故障排除部分）。这主要是由于细胞制备过程耗时较长，以及在分离前需要进行多项步骤以纯化目标细胞群体。如果将肝脏直接消化为单细胞悬液并立即进行FACS分析，肝细胞与其他非实质细胞之间的大小差异将导致无法有效设置FACS门控。若在未去除造血细胞的情况下使用肝脏非实质细胞，则可能存在大量来源于造血系统的CD133+细胞污染目标组分的风险。此外，通过Miltenyi滤器处理细胞时，仅能收集到单个细胞和极小的细胞簇，从而确保样本不会堵塞FACS进样针头。
该实验方案的替代方法包括针对其他细胞表面标志物（如CD49f、EpCAM）或多种标志物组合（如CD133+EpCAM+）进行调整。另一项已发表的研究采用密度梯度法从非实质细胞组分中分离肝干细胞。该方法需要使用超速离心机（8000 × g），显著延长实验时间，且据我们经验，会明显降低FACS前的细胞得率以及FACS后的细胞活力。8
未来的实验包括更广泛的基因表达分析，如胎儿肝脏基因HNF3、HNF4α和αfp。此外，还可利用蛋白质印迹分析和免疫细胞化学方法检测表达的蛋白质，以验证培养细胞中RT-PCR的结果。
需要注意的一个问题是，近期有研究发现肝星状细胞上表达CD133。25 目前我们常规对样本进行肝星状细胞标志物的筛查（参见故障排除部分），但在我们的组分中未发现明显的污染。这可能与不同的肝脏消化和细胞分离技术有关。2,3,26
基于大多数细胞在流式细胞术分选（FACS）分离后无法立即存活的事实，我们建议在将细胞用于动物实验之前，先将其以批量的CD133+细胞或单细胞形式进行培养。体外培养5至7天可显著改善肿瘤分析结果。此外，鉴于单细胞分离过程较为严苛，应仅在批量分离的CD133+细胞能够扩增形成克隆后，再进行单细胞分离操作。关于培养肝干细胞和前体细胞时可采用的不同培养条件及支架蛋白，Lola Reid 已进行了更为详尽的论述。该研究提供了可供研究人员在掌握基本分离技术后引入其研究体系的替代性条件与优化方案27,28。Reid 博士的工作还对肝干细胞与定向前体细胞之间的谱系生物学及成熟过程进行了更深入的分析。
就……而言 体内 肿瘤分析中，我们已成功使用了 freshly isolated cells 以及来自克隆扩增的 CD133+ 细胞的细胞 体外，主要使用 1x106 细胞。我们重点关注了两种慢性肝损伤的遗传品系，MAT1a-/- 以及肝脏特异性的 Pten-/- 小鼠，我们已使用裸鼠和野生型小鼠作为肿瘤生长的宿主。根据我们的经验，CD133+ 肝干细胞仅在从具有显著肝损伤且处于癌前状态的模型中分离时才能形成肿瘤。需要注意的是，由 CD133+ 细胞形成的肿瘤通常同时具有肝细胞癌和胆管细胞癌的特征，提示这些肿瘤起源于干细胞或前体细胞。2-4,29
在记录肿瘤后，后续工作包括对肿瘤组织进行常规病理学分析（H&amp;E染色）以及免疫组织化学染色。此外，肿瘤组织可被切碎并消化，用于流式细胞术分析或重新培养。2-4,30
综上所述，我们详细描述了一种分离、扩增和基本表征CD133+肝干细胞及CD133+肿瘤干细胞的方法。
故障排除：
CD45 污染：
在步骤3中，如果出现CD45+细胞污染，可在FACS分析和分选前加入CD45-FITC抗体进行评估。此时应检查CD45磁珠抗体是否过期，并确保仅在滤器置于磁力架中时收集滤过液。若在滤器未置于磁力架中时收集滤过液，则其中将含有CD45+细胞。
细胞数量过少：
对于未受损的肝脏，分离得到的CD133+非实质细胞总数可能少于10,000个。这类细胞在静息状态的肝脏中极为稀少。而在慢性损伤模型（如0.1% DDC饮食模型）中，细胞数量将显著增加至100,000个。如果获得的总细胞数明显低于上述范围，应考虑流式细胞术抗体染色环节是否存在问题。需检查CD133抗体是否过期，因为染色效果不佳会导致细胞得率低下。此外，我们建议在进行流式细胞术分离前，先对肝脏非实质细胞进行流式细胞分析，以确定目标细胞的相对比例。
FACS 后细胞活力低：
细胞活力下降的问题可能与细胞处理方式及处理时间有关。理想情况下，整个细胞分离过程（步骤1-4）应连续进行，各步骤之间不得有任何延迟，并在同一天内完成。步骤1至4之间的任何显著延迟都会大幅降低细胞活力。影响细胞活力的第二个因素可能与FACS分离时使用的鞘液压力有关。我们建议使用较低的鞘液压力。最后，细胞分离后应立即接种，因为在分选后若在冰上长时间存放，也会降低细胞活力。
CD133+ 非实质细胞异质性：
近期有报道称，肝星状细胞也可能表达CD133，并具有一定的可塑性。25 因此，除了使用Albumin和Krt19验证双潜能基因外，还可进一步检测与星状细胞相关的基因，例如静息状态星状细胞中的胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein），以及活化星状细胞中的α-平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin）和结蛋白（desmin）。3,4,26 此外，CD133+细胞群代表了一个更广泛的前体细胞群体。加入第二个标记物（如EpCAM）可能有助于进一步细化该细胞群体，减少异质性。

<table><tbody><tr><td>DMEM:F12</td><td>Invitrogen</td><td>10565-018</td><td>含酚红</td></tr><tr><td>CD45 磁珠</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-301</td><td></td></tr><tr><td>肝细胞生长因子</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1404</td><td></td></tr><tr><td>表皮生长因子</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4127</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td>1 克</td></tr><tr><td>胶原酶 D</td><td>Roche Group</td><td>1088874</td><td></td></tr><tr><td>链霉蛋白酶</td><td>Roche Group</td><td>0165921</td><td></td></tr><tr><td>70 微米滤网筛</td><td>Fisher Scientific</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Omniscript RT</td><td>Qiagen</td><td>205111</td><td>50 次反应</td></tr><tr><td>HotStarTaq</td><td>Qiagen</td><td>203203</td><td></td></tr><tr><td>Miltenyi LD 柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>CD133-PE FACS 抗体</td><td>eBioscience</td><td>12-1331-82</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白包被板</td><td>BD Biosciences</td><td>354410</td><td>96 孔</td></tr><tr><td>0.05% EDTA 胰蛋白酶</td><td>Invitrogen</td><td>25300-354</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>RNeasy 微量提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>50 个柱，适用于 5×10&lt;sup&gt;5&lt;/sup&gt; 个细胞或更少</td></tr><tr><td>Pharm Lyse</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td>10 倍浓度</td></tr></tbody></table>

cd133+ 肝干细胞的分离与克隆扩增

Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion

肝干细胞，又称卵圆细胞，在慢性肝损伤期间会增殖，并被认为可分化为肝细胞和胆管细胞。此外，肝干细胞还被认为是肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma）这一肝癌亚型的前体细胞。在肝脏等实体器官中开展干细胞研究的主要挑战之一，是分离出稀有细胞群体以进行深入分析。例如，肝脏中绝大多数细胞为肝细胞（实质细胞组分），其体积显著大于非实质细胞。通过富集肝脏特定的细胞组分（即实质与非实质细胞组分），并筛选CD45阴性细胞，可使起始的干细胞群体富集超过600倍。本报告所述的实验流程可实现对实体器官中相对稀有细胞群体的高效分选。该方法可用于从正常小鼠肝脏以及慢性肝损伤模型中分离肝干细胞，后者表现出肝干细胞增殖的增加。与传统的冷冻或福尔马林固定肝脏组织的免疫组织化学方法相比，本方法具有明显优势，因在初步共定位实验后，还可利用活细胞开展功能研究。为完成本报告所述操作，强烈建议与基于科研的流式细胞术核心平台建立合作关系，因为荧光激活细胞分选（FACS）的细节高度依赖专业仪器设备以及对基础流式细胞术操作的熟练掌握。本方法的特定目标是分离出可进行克隆扩增的肝干细胞群体。 体外.

本文介绍了从小鼠全肝脏中分离表达CD133的肝干细胞和肿瘤干细胞的方法，该过程包括组织消化、细胞富集和流式细胞术分离。我们还提供了单细胞分离和克隆扩增的先进技术方案。

CD133+ 肝干细胞的分离与克隆扩增

肝干细胞，即卵圆细胞，在慢性肝损伤期间增殖，被认为可分化为肝细胞和胆管细胞。在……

本视频演示了一种分离肝干细胞以研究克隆扩增的方法，该方法基于慢性肝损伤后CD133细胞表面标志物的表达。首先，从患有慢性肝损伤的小鼠体内取出肝脏，并进行消化处理以获得单细胞悬液。随后加入红细胞裂解缓冲液以去除红细胞，然后将溶液加载至含有磁性CD45抗体的层析柱中，以去除CD45阳性的白细胞。随后对CD45耗竭的细胞进行分选，以富集CD133阳性的肝干细胞。最终分离得到的CD133阳性肝干细胞进行培养并扩增。体外基因和蛋白质表达分析表明，分离得到的CD133阳性干细胞能够分化为肝细胞和成骨细胞。与现有方法（如使用免疫组织化学技术进行标志物共定位）相比，该技术的主要优势在于能够分离单个细胞，用于克隆扩增和功能分析。为验证干细胞和前体细胞表型，本技术的示范操作将由我本人及我实验室的研究生 He Dang 共同完成。所有缓冲液需提前 24 小时在培养基中配制，并在使用前于 4°C 保存。培养基、器械、滤器和试管应保持无菌，并使用无菌操作技术处理。为降低污染风险，应用70%乙醇擦拭安乐死小鼠的腹部区域。使用无菌器械打开腹腔，并将肝脏暴露于视野中。从移植的肝脏中移除胆囊，然后将整个肝脏转移至超净工作台中的无菌密闭培养皿内，使用无菌剃须刀片通过多次水平和垂直切割将肝脏切碎。切碎后，将肝脏组织分成四份，每份放入一个15毫升离心管中，并加入10毫升酶消化液。随后将离心管置于37°C水浴中，在摇床上以每秒1至2个循环的速度振荡消化45分钟。孵育后，用70%乙醇擦拭管子。然后在超净工作台中，将消化后的肝组织匀浆通过70微米孔径的滤网过滤，收集滤过液至无菌培养皿中，以去除含有较大肝细胞的实质部分。用两毫升等分的无菌添加D-M-E-M-F 12培养基冲洗滤网。使用注射器活塞的橡胶端将消化后的果浆压过滤器。重复此操作五次，得到总体积约为20毫升的液体。将滤液均分为两份，分别加入两个15毫升的离心管中，然后在4°C条件下以50 × g离心1分钟。离心后，将上清液转移至标记为snat 1号的离心管中，并弃去实质部分。接下来，为收集含有干细胞和祖细胞的非实质组分，将1号上清液以50 × g离心1分钟。将上清液转移至标记为“上清液二”的离心管中，并再次弃去沉淀。然后将上清液二在50 × g条件下离心1分钟。离心后，将上清液转移至标记为上清液编号三的离心管中，并弃去沉淀。最后，将最终的上清液编号三以180 × g离心8分钟，以获得非实质部分；离心后弃去上清液，并立即进入实验方案的下一步操作，即对红细胞和沉淀进行裂解。用于此步骤的红细胞裂解缓冲液和MilliQ水缓冲液应按照随附书面文件中的说明，在前一晚配制并保存于4 °C。在超净工作台中操作，将细胞和溶液置于冰上。用1毫升1倍稀释的红细胞裂解缓冲液重悬上一步得到的非实质细胞沉淀，并转移至5毫升离心管中。盖紧管盖，轻轻涡旋振荡5秒。在4°C下孵育15分钟。15分钟后避光保护。以200 × g离心5分钟，离心后弃去上清液，上清液中含有裂解的红细胞和resus。将沉淀物重悬于1毫升冰上，冰冷且无菌的E缓冲液中，以200 × g离心5分钟。离心后，弃去上清液，并将沉淀物重新悬浮于1毫升冰冷且无菌的溶液中。米尔顿e缓冲液。然后取出10微升该细胞悬液，加入10微升台盼蓝。使用血细胞计数板对非实质细胞进行计数，以从非实质细胞组分中去除CD45造血细胞。在超净工作台中开始操作，将细胞浓度调整为每100微升融解缓冲液中含有10的7次方至10的8次方个细胞。整个操作过程中务必保持细胞和缓冲液处于低温状态。接下来，每1000万个细胞加入20 µL Miltenyi CD45微珠抗体，4°C孵育15分钟。孵育结束后，加入额外的2 mL Miltenyi缓冲液，以200 × g离心5分钟。离心后，弃去上清液，将最多10⁸个细胞重悬于1 mL中。在超净工作台中，将Milt置于任意缓冲液内，然后将任意LD磁性柱放入磁力架中。在滤器下方放置一个无菌的5毫升离心管以收集滤液。随后加入2毫升样品。融化缓冲液以进行滤膜预洗。洗涤完成后，将细胞上样至柱中。当细胞悬液完全进入柱内后，加入一毫升融化缓冲液洗涤柱子，重复此洗涤步骤两次。请勿使用随柱提供的推杆来加快过滤速度。完成所有洗涤步骤后，将收集到的CD45耗竭的非实质细胞滤液在200 × g下离心5分钟。弃去含有滞留的CD45阳性细胞的柱子。接下来进行流式细胞术以分离CD133阳性细胞，将细胞重悬于Milt缓冲液中，每100微升分装10^7个细胞，取100微升分装至三支试管中。向第一支试管中加入2微升CD133-PE偶联抗体，向第二支试管中加入IgG-PE偶联抗体作为对照。第三个细胞管作为未染色对照，在避光条件下于4摄氏度孵育15分钟，孵育后加入2毫升染色缓冲液重悬，以200 × g离心5分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于1毫升Miltonoye缓冲液中。接下来，在流式细胞仪上使用未染色细胞和IGPE染色细胞调整分选参数，以优化CD133阳性细胞群的设门。我们的 FICO ERYN 或 RPE 通常可与任何发射波长为 488 纳米激光的流式细胞仪配合使用。最后，使用 CD133 阳性门控分离 CD133 阳性细胞群，并将细胞收集至无菌过滤的卵圆细胞培养基中。此后可对细胞进行培养，进行单克隆分离，随后通过实时 PCR 检测评估 CD133 的潜在状态。如本视频中所示，从野生型和MAT1A基因敲除小鼠中分离出肝脏干细胞。在野生型小鼠未受损肝脏来源的高度富集的CD45阴性非实质细胞对照组分中，CD133阳性细胞占0.4%；而在遗传性MAT1A基因敲除（MAT1A−/−）小鼠中，该模型模拟慢性肝损伤，同一高度富集组分中的CD133阳性细胞群体扩增了十倍或更多。分选后的细胞进行培养并扩增克隆。图中显示的是在层粘连蛋白包被的96孔板上由单个CD133阳性细胞扩增获得的四个克隆的相差显微图像。这些细胞为分离后第7天，此时克隆约含25个细胞，呈现为小而致密的上皮样细胞集落。从细胞中提取RNA，并通过这些RT-PCR实验分析胆管细胞标志物CK19的基因表达。基因表达结果显示肝细胞标志物白蛋白和胆管细胞标志物CK19均有表达，证实了CD133阳性细胞的分化潜能。在最初分离并体外扩增CD133阳性单细胞数周后，将来自mat1 A−−模型的1×10⁶个细胞皮下注射到免疫缺陷裸鼠体内。箭头指示细胞注射四周后形成的肿瘤。来自CCl4或0.1% DDC饮食诱导的慢性肝损伤的CD133阳性细胞不会形成肿瘤。体内成瘤实验用于鉴定干细胞群体中的恶性潜能或癌症干细胞表型。一旦掌握，该技术若操作得当可在8小时内完成。通过本实验步骤，可进一步添加其他事实标记物（如EPAM等）。还可采用侧群flx等技术，以回答更多问题，例如进一步明确肝前体细胞群体的表面标记物。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用流式细胞术分离肝干细胞和前体细胞。请注意，处理动物组织可能存在危险，因此在进行本实验操作时，应始终采取佩戴手套等防护措施及规范的实验室操作技术。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

分离的CD133 +肝干细胞的克隆扩增

根据细胞贴壁速度从肌肉骨骼软组织中分离成体干细胞。...

从软性肌肉骨骼组织中分离干细胞

本视频介绍了利用磁性激活细胞分选技术从原代黑色素瘤细胞系中分离CD133阴性和阳性黑色素瘤干细胞的方法。进一步研究CD133阳性的黑色素瘤肿瘤干细胞，以理解黑色素瘤发生机制。...

黑色素瘤干细胞分离：利用磁性激活细胞分选技术获取CD133阳性和阴性黑色素瘤细胞的方法

本视频演示了从人肝组织中分离淋巴细胞（包括自然杀伤细胞或NK细胞）以进行选择性扩增的方法。通过酶消化和机械消化，随后进行密度梯度分离，可有效促进包括NK细胞在内的淋巴细胞分离。所获得的淋巴细胞可用于NK细胞的选择性扩增。...

从肝组织中分离自然杀伤细胞以实现选择性扩增

本视频展示了一种构建人免疫系统（HIS）小鼠模型的技术。从人脐带血富集层细胞中，使用抗体包被的磁珠分离出 CD34+ 造血干细胞（HSCs）。CD34+ HSCs 在富含细胞因子的生长培养基中进行扩增，并进行冷冻保存。最后，将解冻后的 HSCs 注射到免疫缺陷小鼠幼鼠体内，以建立 HIS...

分离脐带血造血干细胞以制备人免疫系统小鼠

本文介绍了如何将新鲜获取的黑色素瘤组织制备成原代细胞培养物，以及如何去除肿瘤细胞中红细胞和成纤维细胞的污染。最后，我们描述了如何利用磁性激活细胞分选技术（MACS）从CD133-主体细胞中分选出CD133+的黑色素瘤干细胞样细胞。...

患者来源的细胞培养及从黑色素瘤中分离CD133+潜在肿瘤干细胞

本文介绍了一种分离并进一步研究人母胎界面——即底蜕膜和壁蜕膜中浸润性白细胞的实验方案。该方案可保持细胞表面标志物的完整性，并获得足量的活细胞，已通过流式细胞术分析验证可用于后续实验应用。...

从人类母胎界面分离白细胞

本文描述了一种从同一供体分离人类肝细胞和非实质肝脏细胞的技术。不同类型的肝脏细胞构成了功能性肝脏模型和组织工程的基础。该新方法旨在以高得率和高活性分离肝脏细胞。...

原代人肝细胞及其主要非实质肝细胞群的分离方案

我们报道了一种从基因工程小鼠模型中分离和培养原代肿瘤特异性内皮细胞的可靠方法。...

分离与培养扩增肿瘤特异性内皮细胞

肝脏损伤伴随前体细胞的扩增，这些前体细胞构成一个异质性的细胞群体。对该细胞区室进行新的分类，有助于区分多个细胞亚群。本文所述方法展示了通过流式细胞术分析及高纯度分离各类亚群的技术流程，所获细胞可用于后续多种实验分析。...

利用新型表面标志物组合分离和富集肝前体细胞亚群

本方案介绍了一种安全且高效的CD133+造血干细胞修饰方法。所展示的非病毒性、基于磁性多聚复合物（polyplex）的技术，可为优化治疗性干细胞效应以及通过磁共振成像监测所给予的细胞产品提供基础。...

将microRNA导入成年骨髓来源造血干细胞的方案：实现细胞工程与磁性靶向的结合

本文旨在提供一种标准化的方法，以诱导人多能干细胞分化为肝祖细胞。该实验流程结合即用型培养基配方，为用户提供了便捷的系统，可用于生成人肝细胞，服务于生物医学研究及转化应用。...

利用定义明确的分化系统从多能干细胞诱导肝祖细胞分化

了解从小鼠肝脏分离CD133阳性肝干细胞并进行克隆扩增的方法。该技术通过流式细胞术实现单细胞分离，支持干细胞功能分析与分化研究，为肝脏再生和癌症研究提供重要工具。

CD133+ 肝干细胞的分离与克隆扩增

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