Name: Hsp104纯化，蛋白质Disaggregase (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: 学习从酵母中纯化高活性Hsp104蛋白质解聚酶的方法，该方案采用His6标签亲和纯化、阴离子交换层析、TEV蛋白酶切割标签及尺寸排阻层析等步骤，可获得适用于结构与功能研究的高质量蛋白产物。

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本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）资助（5T32GM008275-22）以及美国心脏协会博士前奖学金（授予 E.A.S.）；美国国立卫生研究院化学-生物学交叉领域奖学金（2T32GM071339-06A1）（授予 M.E.D.）；以及美国国立卫生研究院（1DP2OD002177-01 和 NS067354-0110）、艾伦医学基金会和比尔及梅琳达·盖茨基金会（授予 J.S.）的资助。

1. Hsp104 的表达
<ol>
<li>用于纯化的质粒 E. coli，pPROEX-HTb-Hsp104，包含在可诱导启动子控制下的Hsp104开放阅读框 trc 启动子26质粒表达带有N端His标签的Hsp1046-tag，可通过TEV蛋白酶切割去除。将pPROEX-HTb-Hsp104转化至密码子优化的 E. coli BL21-CodonPlus-RIL 细胞（Stratagene，Agilent Technologies），采用常规的细菌转化方法（例如按照制造商说明书操作）。重要的是使用一种密码子优化的 E. coli 由于Hsp104具有异常的密码子偏好性，因此该菌株存在这一特性。</li>
<li>接种100 mL添加有 100μg/mL 氨苄青霉素和 34μg/mL 氯霉素与新鲜转化子共同培养，37°C过夜培养 37°C 以200 rpm振荡培养。</li>
<li>将10 mL过夜培养物接种至6 X 1 L 2XYT培养基中 100μg/mL 氨苄青霉素和 34μg/mL 2L 锥形瓶中加入氯霉素，250 rpm 振荡培养 37°C 直到OD600 = 0.4–0.6。停止振荡，将温度降低至 15°C. 将细胞置于培养箱中静置孵育30分钟，使其充分平衡，直至达到 15°C。一旦 15°C 当达到所需条件时，通过加入IPTG至终浓度1 mM来诱导蛋白表达。于250 rpm转速下振荡培养过夜（12–16小时）。</li>
</ol>
2. 细胞收获与裂解
<ol>
<li> 在4°C下，使用预冷转子以4,000 rpm离心20分钟收集细胞（我们使用Sorvall RC 3BP+离心机）。后续步骤必须立即进行，因为大肠杆菌（E. coli）细胞冷冻后Hsp104的活性会降低。此外，所有后续操作均需在冰上或4°C下进行。</li>
<li> 将细胞沉淀重悬于预冷（置于冰上）的10 mL裂解缓冲液中（40 mM HEPES-KOH pH 7.4，500 mM KCl，20 mM MgCl2，2.5% (w/v) 甘油，20 mM 咪唑，5 μM 抑肽酶A，完全蛋白酶抑制剂混合物（每50 mL加入1片无EDTA片剂）和2 mM β-巯基乙醇）。</li>
<li> 使用配备浸入冰水中的热交换器的法国压（Emulsiflex）均质器裂解细胞。使用前确保所有细胞团块均已溶解。在用裂解缓冲液平衡均质器后，以15,000–18,000 psi的压力通过柱体两次即可实现完全裂解。若无法国压，可采用溶菌酶孵育后超声处理的方法（见讨论部分）。保留少量裂解后的细胞样品用于SDS-PAGE分析（1 μL）（见图2中的Lysate）。</li>
<li> 在4°C下以16,000 rpm离心20分钟去除细胞碎片（我们使用Sorvall RC5C+离心机）。保留上清液用于下一步，并取少量上清液（1 μL）用于SDS-PAGE分析（见图2中的Ni Load）。</li>
</ol>
3. Hsp104 纯化
<ol>
<li>将步骤2.4的上清液与12 mL（每1 L细胞使用2 mL Ni-Sepharose凝胶珠）已用裂解缓冲液平衡的50% Ni-Sepharose凝胶珠悬液（GE）混合。</li>
<li>缓慢旋转样品 3 小时，温度为 4°C 使Ni-Sepharose保持均匀悬浮并尽量减少起泡。较短的孵育时间虽可行，但会降低产量。在 4°C 在蛋白酶抑制剂存在下，降解极少发生，且Ni-Sepharose孵育3小时不会降低终产物的活性。将Ni-Sepharose于2分钟内离心收集 4°C 在2,000 rpm（Eppendorf 5810R 离心机）条件下离心。保留少量上清液用于SDS-PAGE分析（1μL）并弃去其余部分（见图2中的Ni流穿液（FT））。</li>
<li>用25个柱体积的洗涤缓冲液（40 mM HEPES-KOH pH 7.4，150 mM KCl，20 mM MgCl₂）洗涤回收的Ni-Sepharose2，2.5% (w/v) 甘油，20 mM 咪唑，2 mM β-巯基乙醇），用含 1 M KCl 的洗涤缓冲液洗涤 5 个柱体积以去除静电结合至 Hsp104 的杂质，再用洗涤缓冲液洗涤 25 个柱体积。每次洗涤后，通过在 4 °C 下以 13,000 × g 离心 2 分钟收集 Ni-Sepharose 树脂 4°C 在2,000 rpm条件下离心（Eppendorf 5810R离心机）。每次洗涤和离心后，通过抽吸去除缓冲液。</li>
<li>为洗脱 Hsp104，将 Ni-Sepharose 与 1 mL 洗脱缓冲液（40 mM HEPES-KOH pH 7.4，150 mM KCl，20 mM MgCl₂，300 mM 咪唑）混合2，每1 mL Ni-Sepharose中加入2.5% (w/v) 甘油、350 mM 咪唑、2 mM β-巯基乙醇，并旋转孵育 4°C 20分钟。高浓度咪唑会破坏Ni珠与His的结合6 相互作用。通过在2分钟内离心，使用空的1.2 mL离心柱（Bio-Rad）去除Ni-Sepharose 4°C 在 2,000 rpm（Eppendorf 5810R 离心机）下离心。保存 1μL 用于SDS-PAGE分析的洗脱液（如图2中的Ni洗脱液）。每升细胞在此步骤中可获得约15 mg的Hsp104。</li>
<li> 将缓冲液交换洗脱液置换至缓冲液Q（20 mM Tris-HCl pH 8，0.5 mM EDTA，5 mM MgCl₂）2，50 mM NaCl）使用截留分子量为30,000的Amicon Ultra（Millipore）15 mL离心浓缩装置进行浓缩。首先将蛋白质浓缩至约1.5 mL，然后加入14.5 mL缓冲液Q以将蛋白质稀释10倍。重复此步骤3次以完成缓冲液置换。提高的pH值和低盐条件可确保Hsp104带有较高的负电荷。</li>
<li>使用以缓冲液Q平衡的Resource Q 6 mL柱（GE）通过阴离子交换色谱纯化Hsp104。上样前，蛋白样品经低蛋白吸附的Millex GP PES膜过滤 0.22μm 注射器滤器（Millipore）。流速设定为1 mL/min。用1个柱体积的20%缓冲液Q+（20 mM Tris-HCl pH 8，0.5 mM EDTA，5 mM MgCl）洗去弱结合蛋白2，1 M NaCl）。以线性梯度（20%–50% Buffer Q+）洗脱Hsp104，洗脱体积为5个柱体积（图3）。收集每管1 ml的组分。Hsp104及其大多数变体通常在约400 mM NaCl（31 mS/cm）时洗脱。保留主峰组分的样品（1μL用于 SDS-PAGE 分析（图 3，插图）。</li>
<li>去除 His6-tag，使用Amicon离心浓缩器按照上述方法（见步骤3.5）将蛋白置换至裂解缓冲液中（20 mM HEPES-KOH pH 7.4，140 mM KCl，10 mM MgCl₂）2）。根据制造商说明书使用 proTEV 蛋白酶（Promega）或 AcTEV 蛋白酶（Invitrogen）。对于 Hsp104，我们发现需要更高的 TEV 蛋白酶：Hsp104 比例才能实现完全切割。我们采用每 1 个蛋白酶单位对应 12μg Hsp104。切割应在 30°C 2-4 小时，随后在 16 小时内孵育 4°C最终 Hsp104 浓度应在 20-75μM 单体。通过加入过量的Ni-Sepharose（GE）去除裂解反应中残留的His6标签Hsp104和TEV蛋白酶（假设每毫升压实体积的树脂可结合15 mg蛋白质）。使用空的离心柱（Bio-Rad）在2,000 rpm转速下离心2分钟，去除树脂珠。 4°C在切割前后收集样品（1μL用于SDS-PAGE分析，以确认切割效果并去除未切割的蛋白（图4）。</li>
<li>置换至尺寸排阻缓冲液（20 mM HEPES-KOH pH 7.4，140 mM KCl，10 mM MgCl₂）2，0.1 mM EDTA，1 mM DTT）使用MWCO 30,000 Amicon Ultra（Millipore）进行浓缩，方法如步骤3.5所述。</li>
<li>通过尺寸排阻色谱进一步纯化 Hsp104。使用以尺寸排阻缓冲液平衡的 Superose 6 或 Superdex 200 柱（均来自 GE）（图 5）。上样前，蛋白质样品需经低蛋白吸附的 Millex GP PES 膜过滤 0.22μm 注射器滤器（Millipore）。对于少于10 mg的蛋白质样品，可使用10/300规格柱子（24 mL），收集0.5 mL的组分；对于大于10 mg的样品，应使用12/60规格柱子（120 mL），并收集1 mL的组分。请参考生产商说明书确定流速和上样体积。纯化后，根据图5所示合并Hsp104组分，并使用Amicon离心浓缩装置（Millipore）进行浓缩。编辑说明：视频旁白错误地陈述了 0.22μM （微摩尔）注射器滤器，应注明 0.22μm （微米）注射器滤膜，时间码 04:38]。Hsp104 的保存方法如下所述。由于在分离 Hsp104 降解产物和杂质过程中会造成材料损失，每升起始培养物最终获得的纯化全长 Hsp104 产量约为 1–3 mg。</li>
</ol>
4. Hsp104 去聚集酶活性
<ol>
<li>纯化后，建议通过去聚集实验评估 Hsp104 的活性。通常我们采用荧光素酶复性实验2（图 6）。在此实验中，Hsp104 与 Hsp70 分子伴侣系统（Hsp70 和 Hsp40）协同作用，可解聚经尿素变性的萤火虫荧光素酶聚集体2。可溶性荧光素酶催化荧光素氧化为氧荧光素，该反应会释放光信号。通过检测发光强度，可确定荧光素酶的相对复性程度，从而反映其去聚集能力。Hsp104 必须能够与 Hsp70 共伴侣系统协同作用。荧光信号的恢复量取决于所使用的特定 Hsp70:Hsp40 配对组合。我们常规使用 Hsp72 和 Hsp40（Assay Designs）。作为最低标准，活性良好的 Hsp104 应使荧光素酶的复性效率较仅由 Hsp72:Hsp40 介导的复性提高至少 5 倍（图 6）。未能达到此活性水平的 Hsp104 制剂将被弃用。</li>
</ol>
5. Hsp104 储存
<ol>
<li>短期储存时，Hsp104 可保存于 4°C 在尺寸排阻缓冲液中。然而，活性在2-3天后会下降 4°C 1 周后急剧下降 4°C我们建议在纯化后尽快使用 Hsp104 进行解聚实验。理想情况下，Hsp104 应在纯化后立即用于淀粉样蛋白解聚实验。</li>
<li>如果蛋白质需要长期储存，需将 Hsp104 置换至储存缓冲液（20 mM HEPES-KOH pH 7.4，140 mM KCl，10 mM MgCl₂）中2，0.1 mM EDTA，1 mM DTT，10% 甘油（w/v）。 100μl 分装样品在液氮中速冻，并于 -80°C冻融循环会显著降低 Hsp104 活性，应避免。我们建议将 Hsp104 置于冰上缓慢解冻。在 -80 °C 条件下保存超过 1 个月后，淀粉样蛋白解聚酶活性将急剧下降。80°C.</li>
</ol>
6. 代表性结果与图示：
<img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig1.jpg" alt="Hsp104、Hsp70 和 Hsp40 参与的蛋白质聚集过程示意图，展示复性过程。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. Hsp104 是一种双功能去聚集酶。 紊乱聚集体（左侧所示）的解聚需要 Hsp70 分子伴侣系统（Hsp70 和 Hsp40）的协同作用2Hsp104 可在无需 Hsp70 和 Hsp40 协助的情况下重塑有序的淀粉样蛋白聚集体（如右图所示） 体外，但Hsp70和Hsp40可增强Hsp104对淀粉样蛋白的活性26,28对于这两种类型的聚集体结构，Hsp104 通过其中央通道将 ATP 水解与底物转运相偶联，从而促进去聚集。含酪氨酸的孔环可结合底物并将其通过中央通道转运。49-52.
<img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig2.jpg" alt="显示蛋白质纯化过程及分子量标记的SDS-PAGE凝胶电泳结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 图2. Ni-Sepharose亲和纯化步骤的SDS-PAGE分析。 裂解液、Ni上样、Ni流穿和Ni洗脱组分通过4-20% Tris-HCl 1.0 mm Criterion凝胶（Bio-Rad）进行SDS-PAGE分离，并用考马斯亮蓝染色。注意，并非所有的Hsp104都能结合到Ni-Sepharose上。左侧泳道显示了宽范围分子量标记物（Bio-Rad）。
<img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig3.jpg" alt="280 nm 吸光度色谱图，显示蛋白纯化过程及电泳结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 图 3. Ni-Sepharose 洗脱液的 Resource Q 纯化。 蓝色曲线表示 280 nm 处的吸光度，绿色曲线表示缓冲液 Q+ 的百分比（最高为 50%）。第一个在 20% Q+ 处洗脱的峰含有杂质、降解产物以及错误折叠的 Hsp104；第二个为主要峰，含有正确折叠且具有活性的 Hsp104。流速为 1 ml/min。从 20% 至 50% Q+ 的梯度洗脱时间为 30 分钟或 5 个柱体积。插图：收集的峰组分经 SDS-PAGE 分析，使用 4–20% Tris-HCl 1.0 mm Criterion 凝胶（Bio-Rad），考马斯亮蓝染色。左侧显示宽范围分子量标准蛋白（Bio-Rad）。
<img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig4.jpg" alt="SDS-PAGE蛋白质电泳结果，分子量标记物，切割前和切割后分析，kDa。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 图4. proTEV蛋白酶切割步骤的SDS-PAGE分析。来自Resource Q纯化的His6-Hsp104在30°C下用proTEV蛋白酶处理4小时，随后在4°C下处理16小时。样品通过SDS-PAGE在4-20% Tris-HCl 1.0 mm Criterion凝胶（Bio-Rad）上进行分离，并用考马斯亮蓝染色。注意，经proTEV切割后的Hsp104迁移速度更快。TEV蛋白酶和未切割的Hsp104已如步骤3.7所述通过Ni-Sepharose去除。左侧显示的是宽范围分子量标记物（Bio-Rad）。
<img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig5.jpg" alt="蛋白质纯化层析图谱；吸光度 vs. 体积；插图为凝胶电泳。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 图 5. Hsp104 的凝胶过滤纯化。 经切割后的 Hsp104 通过 Superose 6 凝胶过滤柱（10/300，GE）进一步纯化。流速 = 0.4 ml/min。虚线之间的峰代表收集的组分。插图：收集的峰组分使用 4–20% Tris-HCl 1.0 mm Criterion 凝胶（Bio-Rad）进行 SDS-PAGE 分析，并用考马斯亮蓝染色。左侧显示的是宽范围分子量标准蛋白（Bio-Rad）。
<img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig6.jpg" alt="比较 Hsp40/Hsp72、Hsp104 以及 Hsp104 与 Hsp40/Hsp72 之间发光强度的柱状图" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 6"> 图 6. 萤光素酶再活化实验。 变性的萤火虫萤光素酶聚集体（50 nM）分别与 Hsp72 和 Hsp40（均为 Assay Designs 公司产品，1 μM）、Hsp104（6 μM 单体）或 Hsp104、Hsp72 与 Hsp40 一起在 25°C 下孵育 90 分钟。仅在同时存在 Hsp104 与 Hsp40/Hsp72 时，变性萤光素酶才能完全再活化。使用 Infinite M1000 酶标仪（Tecan 公司）测定恢复的发光强度。数据表示为均值±标准误（n=3）。

未声明任何利益冲突。

时间线： 为获得最大 Hsp104 活性，建议尽可能快速完成整个纯化流程。然而，由于纯化步骤较多，所需时间安排较为紧张，可能并不总是具备可操作性。若尽可能快速地进行各步骤，从过夜表达结束到在 30°C 下与 TEV 蛋白酶孵育 2–4 小时为止，总耗时约为 9–11 小时。一个可行的暂停点是在 TEV 切割步骤之后。如有绝对必要，可按照上述方法（步骤 5.2）在此步骤后将 Hsp104 迅速冷冻。随后在解冻后立即进行尺寸排阻色谱（步骤 3.9），且纯化后的 Hsp104 必须立即用于生化检测。此外，诱导步骤也可简化为在 37°C 下进行 2 小时，尽管这会降低总体产量。
可能的并发症： 该纯化方案是直接的。然而，以下讨论了一些关键步骤和替代方案。
替代性细胞裂解：若无法国压菌器（French Press），可采用溶菌酶处理结合超声破碎的方法进行有效细胞裂解。将裂解缓冲液重悬的细胞与溶菌酶（Sigma，鸡蛋清来源）在冰上孵育30分钟，每1 L细胞沉淀加入20 mg溶菌酶，使终浓度达到2 mg/mL。随后使用M...

<table><tbody><tr><td>BL21-CodonPlus-RIL 感受态细胞</td><td>Stratagene, Agilent Technologies</td><td>230255</td><td></td></tr><tr><td>2XYT 肉汤</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>75864</td><td></td></tr><tr><td>Complete, mini, 无 EDTA 蛋白酶抑制剂片剂</td><td>Roche Group</td><td>1836170</td><td></td></tr><tr><td>胃蛋白酶抑制剂 A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4265</td><td></td></tr><tr><td>Ni-Sepharose 6 快流介质</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5318-02</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 离心滤过装置（截留分子量 30,000）</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC903008</td><td></td></tr><tr><td>Resource Q - 6 ml 柱</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1179-01</td><td></td></tr><tr><td>proTEV 蛋白酶</td><td>Promega Corp.</td><td>V6052</td><td></td></tr><tr><td>AcTEV 蛋白酶</td><td>Invitrogen</td><td>12575015</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL 柱</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>Hsp40</td><td>Assay Designs</td><td>SPP-400</td><td></td></tr><tr><td>Hsp72</td><td>Assay Designs</td><td>ADI-NSP-555</td><td></td></tr></tbody></table>

hsp104蛋白解聚酶的纯化

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 是一种来自酵母的六聚体 AAA+ 蛋白1，可通过水解 ATP 驱动蛋白质去聚集2-10（图 1）。该活性赋予酵母两种关键的选择优势。首先，Hsp104 对无序聚集体的重折叠能力使其在多种蛋白质错误折叠应激（包括热休克）后仍能存活3,5,11,12。其次，Hsp104 对交叉β淀粉样纤维的重塑能力使酵母能够利用多种朊病毒（传染性淀粉样蛋白）作为有益且可遗传的表型变异的储备库13-22。值得注意的是，Hsp104 可直接重塑前淀粉样寡聚体和淀粉样纤维，包括由酵母朊病毒蛋白 Sup35 和 Ure2 组成的纤维23-30。这种淀粉样蛋白重塑功能是酵母 Hsp104 的特有功能。E. coli 的同源蛋白 ClpB 无法重塑前淀粉样寡聚体或淀粉样纤维26,31,32。
除动物外，Hsp104 的直系同源物存在于所有生命界中，这一点令人费解。事实上，目前尚不清楚动物细胞是否拥有任何将蛋白质去聚集与复性（而非降解）相偶联的酶系统33-35。因此，我们及其他研究者提出，Hsp104 或可被开发为治疗多种神经退行性疾病的治疗剂，这些疾病与特定蛋白质错误折叠形成毒性前淀粉样寡聚体及淀粉样纤维密切相关4,7,23,36-38。目前尚无直接靶向这些疾病相关聚集物的治疗方法。然而，Hsp104 能够溶解由α-突触核蛋白（alpha-synuclein）组成的毒性寡聚体和淀粉样纤维，而这些聚集物与帕金森病相关23，同时也可溶解朊病毒蛋白（PrP）的淀粉样形式39。重要的是，Hsp104 在帕金森病23和亨廷顿病38的啮齿类动物模型中可减少蛋白质聚集并改善神经退行性病变。理想情况下，为优化治疗效果并最小化副作用，可对 Hsp104 进行工程化改造并增强其活性，以选择性地重塑特定疾病中起核心作用的聚集物4,7。然而，目前对 Hsp104 如何去聚集如此多样化的聚集结构及不相关蛋白质的结构与机制理解仍有限，这阻碍了上述努力30,40-42。
为了理解Hsp104的结构与作用机制，有必要对纯化的蛋白进行研究，并以最少的组分重建其解聚酶活性。Hsp104是一种分子量为102 kDa、等电点约为5.3的蛋白质，在ADP或ATP存在下，或在无核苷酸条件下高蛋白浓度时，可形成六聚体。43-46. 此处，我们描述了一种优化的纯化方案，用于获得高活性、高稳定性的 Hsp104 E. coli. 的使用 E. coli 可实现简化的规模化生产，且该方法可快速、可靠地用于大量 Hsp104 变体。我们的方案提高了 Hsp104 的纯度，并简化了 His6与之前的一种纯化方法相比的标签去除 E. coli47此外，我们的方案比另外两种较新的方案更为简便和便捷26,48.

本文介绍一种纯化高活性Hsp104的方案，Hsp104是一种来自酵母的六聚体AAA+蛋白，可将ATP水解与蛋白质去聚集功能相偶联。该方案利用带有His6标签的重组蛋白，从大肠杆菌（E. coli）中进行亲和层析纯化，随后依次进行阴离子交换层析、TEV蛋白酶切除His6标签以及尺寸排阻层析。

Hsp104蛋白解聚酶的纯化

Hsp104 是一种来自酵母的六聚体 AAA+ 蛋白1，可通过水解 ATP 驱动蛋白质去聚集2-10（图 1）。该活性赋予两个关键……

本实验的总体目标是大量制备具有高活性的 HSP 104 A 蛋白去聚集物。首先在优化的大肠杆菌细胞中表达 HSP 104 编码蛋白，随后通过组氨酸亲和标签对 HSP 104 蛋白进行纯化，再结合离子交换柱进一步纯化。离子交换色谱之后，使用 TEV 蛋白酶切除组氨酸标签。最后的纯化步骤是将切除标签后的 HSP 1 0 4 蛋白通过凝胶过滤柱进行纯化。此外，最终还需通过Elif再激活实验来确定是否已纯化出具有活性的HSP104。与现有方案相比，该技术的主要优势在于步骤少且能获得大量高活性的HSP104，适用于结构与机制研究。初学者可能面临挑战，因为大部分纯化步骤需在一天内完成，时间安排较为紧张。在开始本实验方案之前，按照本视频配套书面方案中所述制备 HSP104 纯化所需的所有缓冲液。同时，按照后续文本中详述的步骤，在大肠杆菌中过夜表达 HSP104 蛋白。表达结束后，通过离心收集细胞。将细胞沉淀重悬于 10 毫升预冷的裂解缓冲液中，在使用法国压菌器进行细胞裂解前，确保所有细胞团块均已充分溶解。先用裂解缓冲液平衡压菌器，然后使细胞悬液通过压菌器柱体两次，完成裂解。在15,000至18,000 PS的压力下，通过离心去除细胞碎片，并保留上清液以进行后续纯化。开始纯化HSP104时，将上清液与用裂解缓冲液平衡的50%镍SRO凝胶悬浮液混合。在4°C条件下缓慢旋转孵育样品3小时，使凝胶珠保持均匀悬浮状态，并尽量减少起泡。孵育结束后，通过离心收集镍微球。用25个柱体积的洗涤缓冲液洗涤回收的镍微球。再次离心收集微球，随后用抽吸法去除洗涤缓冲液。然后用含1摩尔氯化钾的洗涤缓冲液清洗磁珠，体积为5个柱体积，随后用25个柱体积的洗涤缓冲液继续清洗。洗脱HSP104时，将镍磁珠与洗脱缓冲液混合，在4摄氏度下旋转孵育20分钟。通过空的 1.2 毫升离心柱离心，将珠子与洗脱液分离。每升细胞可获得约 15 毫克 HSB 1 0 4。在此纯化阶段，使用截留分子量为30,000的离心浓缩装置将洗脱液浓缩至约1.5毫升。然后加入14.5毫升缓冲液Q，使蛋白质溶液稀释十倍。重复此步骤三次以进行缓冲。在通过阴离子交换色谱纯化 HSP104 之前更换蛋白质溶液。使用低蛋白吸附的 0.22 µm 注射式滤器过滤蛋白质。然后将蛋白质注入已用缓冲液Q平衡的6毫升Resource Q柱。用一个柱体积的20%缓冲液B洗去弱结合蛋白，再用五个柱体积的线性梯度洗脱HSB104，收集1毫升的馏分；HSB104及其多数变体通常在约400毫摩尔氯化钠时洗脱。为去除六聚组氨酸标签，使用离心浓缩器置换蛋白质溶液，并根据制造商说明书用TEV蛋白酶切割标签。在30摄氏度下进行切割反应2至4小时，随后在4摄氏度下孵育16小时。通过向切割反应体系中加入过量镍担载的SROs（镍螯合树脂），去除残留的六聚组氨酸标签标记的HSP104和TEV蛋白酶。然后使用空的离心柱通过离心方式从样品中去除树脂微珠。为进行最终纯化步骤，先使用分子量截断值为30,000的离心过滤装置将蛋白质置换到尺寸排阻缓冲液中，随后通过低蛋白吸附的0.22微米注射式滤器过滤。再使用尺寸排阻缓冲液通过尺寸排阻色谱进一步纯化HSP 1 0 4。平衡Super OH六柱。根据制造商的说明进行FPLC运行。纯化后，收集HSP104组分，并使用离心浓缩装置对其进行浓缩，因为在分离HSP104降解产物和杂质时会造成样品损失，因此每升起始培养物最终获得的纯化全长HSP104产量约为1至3毫克。此处显示的是镍螯合亲和纯化后的 SDS-PAGE 分析结果。在裂解液、上样到磁珠的样品、磁珠流穿液以及磁珠洗脱液中，均可观察到带有组氨酸标签的 105 千道尔顿 HSP104 蛋白。需要注意，并非所有的 HSP104 都能结合到镍螯合磁珠上。镍亲和层析后，进一步采用 resource Q 柱进行离子交换层析。蓝色曲线代表在280纳米处的吸光度，绿色曲线代表缓冲液B的百分比。第一个在20% B处洗脱的峰含有杂质、降解产物以及错误折叠的HSP104。主峰经离子交换后SDS-PAGE分析证实含有正确折叠且具有活性的HSP104。HEXA-His标签HSP104蛋白可被ProTeV蛋白酶切割以去除His标签。请注意，蛋白酶切割后的 HSP104 比六聚组氨酸标签蛋白迁移得更快。切割后的 HSP104 随后通过 AUP O six 凝胶过滤柱进一步纯化。虚线之间的峰代表合并的组分。此处展示的是荧光素酶复性实验的结果，该实验用于评估 HSP104 的解聚活性。变性的萤火虫荧光素酶聚集体分别与 HSP40 和 HSP72、HSP104 或 HSP104、HSP40 和 HSP72 共同孵育。只有在同时存在 HSP104 以及 HSP40 和 HSP72 的情况下，变性的荧光素酶才能完全恢复活性，这由发光信号的显著增强得以证明。一旦掌握，若操作正确，该实验方案可在两天内完成。

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生物学

Hsp104纯化，蛋白质Disaggregase

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Hsp104蛋白解聚酶的纯化

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