准备使用一个不连续Percoll蔗糖密度梯度的从小鼠皮质Synaptoneurosomes
2011年9月17日
一个准备从小鼠大脑皮质翻译活跃，完好synaptoneurosomes（SNS）的方法来描述。该方法采用一个不连续Percoll蔗糖密度梯度，允许快速制备活跃的SNS。
该程序的总体目标是使用不连续的 peral 蔗糖密度梯度，从小鼠大脑皮层准备到神经区的翻译活性突触。这是通过首先收集和均质化小鼠皮层，然后离心匀浆来实现的。在此之后，将离心匀浆或补充纳粹应用于 preport per 蔗糖梯度。
最后一步是离心并收集突触体组分。最终，western blot 分析和 S 35 蛋氨酸掺入实验表明，突触体部分在突触上富集且具有翻译活性。与离心和过滤等现有方法相比，该技术的主要优点是，利用密度梯度避免了我们的第一次机械损伤，第二次每次调用对其成分中的细胞具有低毒性。
一般来说，刚接触这种方法的人会为这个协议而苦苦挣扎，因为时间起着关键作用。一旦收获了 cortis，应迅速完成该过程。要开始该程序，请按照随附手稿中的说明将相应量的 SIP 添加到 GM 缓冲液中，准备 3、10、15 和 23% 梯度层并充分混合。
将 23 种 15%、10% 和 3% 等渗 perol 溶液中的每一种 2 毫升移液到带盖的贝克曼离心管中，将梯度层倒入。使用 P 1000 移液器，各层之间的界面应清晰可辨，层之间没有混合。使用前将 4 摄氏度的梯度储存至少 20 分钟。
在开始此过程之前，请按照随附手稿中的说明准备其他必要的解决方案。在 P 13 至 P 21 岁时对小鼠实施安乐死，并通过用 70% 乙醇喷洒颈部和头部后部来准备解剖。然后用一把锋利的剪刀剪断颅底的脊髓。
接下来，去除头骨顶部的皮肤。在顶骨和顶骨之间，或在大脑和皮质区域之间横向切开颅骨。之后，沿着矢状缝线从底部切开头骨到鼻子。
在此步骤中，将每个半球拉到一边，小心地去除柔软的顶骨。之后，将刮刀插入小脑上方的大脑以挖出皮层。将其放入冰冷的 GM 缓冲液中，然后再次重复这些程序以收集更多的皮质。
现在用冰冷的 GM 缓冲液冲洗皮质。然后将两个皮质转移到含有 5 毫升冷 GM 缓冲液的玻璃羽绒均质器中。用 5 到 10 次杵 A 轻轻均匀化皮质，松散的杵，然后是 5 到 10 次杵 B，即型杵。
冲程数因单个均质机而异。将匀浆转移到 15 mL 锥形管中。离心 1000 倍。
在 Allegra 6 KR 离心机中，在 4 摄氏度下重力作用 10 分钟，以沉淀细胞碎片和细胞核。每个或蔗糖梯度分层 2 毫升螺旋盐，每个整个皮层一个梯度并盖上管。然后在 Beckman J 2 21 离心机中，将它们放入固定角转子中，以 32， 500 倍重力在 4 摄氏度下离心 5 分钟。
完成后，使用适当的适配器，梯度应产生强 SN 条带移液器，并丢弃 SN 条带上方的溶液。使用玻璃意大利面移液器在 15% 至 23% 界面处移出 SN 带，一个梯度通常得到约 0.9 至 1.1 mL 的 SNS。之后，将其转移到锥形管中并储存在冰上。
然后通过添加 10 倍刺激缓冲液的 10 倍体积来调整 SNS 的盐浓度。可选添加 1000 倍氯化钙，得到最终浓度为 12 阿诺摩尔。接下来，添加 1 毫摩尔 TTX 原液，使终浓度为 1 微摩尔，以抑制非特异性兴奋。
下一步是在适用的下游应用中使用 SNS，例如蛋白质翻译研究。对于其他应用，可以使用 Pierce SDS 页面样品制备试剂盒对 SN 裂解物进行净化或浓缩。SNS 的蛋白质浓度可以使用微量 BCA 蛋白测定试剂盒测定。
下面是六个条带或分数的示例。当小鼠皮层在不连续的 perol 蔗糖梯度上匀浆和分离时，富集的 SNS 包含在 23% 至 15% 界面的波段 5 中，该波段被去除并通过电子显微镜检查。完整的突触小泡以及突触前和突触后元件保留的实例显示在蛋白质印迹中。
突触标志物的增加和 SN 带中杂质的减少来自不连续的每蔗糖梯度，证实了添加谷氨酸后 S 35 蛋氨酸掺入的增加是由于从头蛋白质合成。添加了 40 μmolar anesa mycin a 蛋白质合成抑制剂。该图显示与基础水平相比，在存在 anso mycin （存在或不存在谷氨酸）的情况下，S 35 蛋氨酸掺入显着减少。
因此，不连续的 peral 蔗糖梯度可快速产生高活性和相对纯的 SNS，可用于研究蛋白质翻译。该图显示，来自不连续每个核心蔗糖梯度的带 5 包含最高水平的从头蛋白质合成。通过与孔径减小的过滤器通过一系列过滤器，然后在不连续的每核心蔗糖梯度上离心以进行比较，与从不连续的 perol 蔗糖梯度法制备的 SNS 相比，通过制备的 SNS 制备的 SNS 含有更多的破膜和更少的全 SNS，使用不连续的 peral 蔗糖梯度法制备的 SNS 显示比使用过滤法制备的 SNS 含有更多的从头蛋白质合成活性。
从年轻小鼠制备的 SNS 被证明比老年小鼠具有更大的翻译活性。观看此视频后，您应该对如何通过在摆动桶式转子中离心匀浆的小鼠皮层、在固定角转子中通过每次调用的蔗糖梯度离心上清液，然后收集得到的突触神经区来分离翻译活跃的突触神经区。
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概述
本文介绍了一种利用不连续Percoll-蔗糖密度梯度从小鼠脑皮层制备具有翻译活性的突触体（SNs）的方法。该技术可实现快速制备，同时最大限度地减少机械损伤和毒性。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 生物化学
背景
- 突触体是研究突触功能的重要工具。
- 传统方法可能对样本造成机械损伤。
- 密度梯度可降低对细胞的毒性。
- 理解突触中的翻译活动对神经科学研究至关重要。
研究目的
- 建立一种可靠的分离活性突触体的方法。
- 提高突触体样本制备的质量，以用于科学研究。
- 促进对突触功能及机制的进一步研究。
使用的方法
- 小鼠脑皮层的匀浆处理。
- 离心匀浆液以分离各组分。
- 将上清液加载至Percoll-蔗糖梯度中。
- 最终离心以收集突触体组分。
主要结果
- Western印迹分析证实了该组分中突触蛋白的富集。
- S35-甲硫氨酸掺入实验表明存在翻译活性。
- 与传统方法相比，该方法能有效减少机械损伤。
- Percoll的低毒性提高了制备样品中的细胞活力。
结论
- 所述方法适用于高效制备具有活性的突触体。
- 该方法为研究突触机制提供了可靠的工具。
- 未来的研究可在此技术基础上拓展多种应用。
常见问题
行业应用价值
突触体分离技术通过保留天然的突触前和突触后蛋白复合物，实现了对突触靶点的机制性风险降低。该方法通过提供能够反映生理状态下神经递质处理的、具有翻译活性的样本，支持神经科学药物发现中的靶点验证。Percoll-蔗糖梯度法减少了机械损伤和细胞毒性带来的假象，提高了先导化合物筛选研究的数据可靠性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过维持突触小泡的摄取、储存和释放机制，验证治疗假设。
- 操作价值：通过评估再封闭末梢中的神经递质动态变化，实现功能靶点的验证。
- 预测价值：通过量化S35标记甲硫氨酸掺入以反映翻译活性，支持对研发项目的优先级筛选。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：为下游检测突触蛋白翻译或药物对囊泡循环影响的实验提供经过验证的生物系统。
- 操作价值：通过可控的梯度分层，获得标准化且可重复的突触小体产量（每皮质0.9–1.1 mL），批次间变异极小。
- 检测适用性：适用于需要完整突触终末并保留突触前和突触后标志物的化合物筛选平台，具有良好的可扩展性。
转化与临床前研究
- 转化连续性：从发现到中枢神经系统靶向调节剂的临床前验证，全程维持与疾病相关的突触蛋白复合物。
- 机制去风险化：通过关联谷氨酸刺激的S35-甲硫氨酸掺入与突触小泡循环，确认靶点作用机制。
- 基于风险评估的推进：根据转化活性水平做出推进或终止决策；该活性在幼年（P13–P21）小鼠皮层中较高，并可被放线菌酮等蛋白质合成抑制剂降低。
流程与工作流整合
该方法适用于从靶点假设验证到先导化合物筛选的发现连续过程，在开展临床前药效学研究之前，突触功能检测可为化合物的优先排序提供依据。
- 发现生物学：通过分离突触富集组分并利用突触标志物的蛋白质印迹法验证及降低杂质水平，支持假设验证。
- 筛选：提供可用于检测的突触体（SNs），具有如S35-甲硫氨酸掺入率等定量输出结果，便于比较化合物对蛋白质合成的影响。
- 分析：生成翻译活性测量数据，帮助研究团队比较不同条件或遗传模型下突触功能状态的差异。
- 转化研究：通过保留与神经退行性疾病或神经精神疾病适应症中生物标志物匹配相关的突触小泡循环机制，衔接临床前研究。
- 企业级复用：建立可重复使用的皮层突触体（SN）制备平台，适用于多个研究突触蛋白质翻译或药物诱导囊泡动力学调控的项目。
运营与企业影响
- 科学价值：通过保留神经递质的摄取、储存和释放能力，实现对突触靶点结合的预测性信心。
- 操作价值：采用等渗Percoll-蔗糖梯度法进行标准化，避免使用细胞毒性培养基并减少离心步骤，提高实验可重复性。
- 战略价值：通过量化翻译活性作为功能性突触读数，优化决策流程，降低中枢神经系统项目在后期阶段的生物学风险。
- 项目组合影响：基于化合物对SN蛋白合成的剂量依赖性效应进行风险校正后的优先级排序，支持在靶点验证中实现资本效率。
实施注意事项
- 需要具备组织解剖、匀浆技术和密度梯度制备方面的专业知识，以避免皮层损伤并确保清晰的分层界面。
- 依赖离心基础设施（摆桶转子和固定角转子）以及全程温度控制（4°C），以维持突触体（SN）的完整性。
- 需要在不同实验团队之间对匀浆冲程次数和梯度层体积进行标准化，以尽量减少突触体产量和活性的个体间差异。
- 适应性考虑因素包括调整P13–P21小鼠的年龄以匹配发育阶段的突触特征，并优化TTX浓度（1 µM），以在后续实验中抑制非特异性神经元兴奋。
- 实际限制包括解剖后需快速处理以防止活性丧失，以及需要通过S35-甲硫氨酸掺入或Western blot验证来确认突触富集效果。
