准备使用一个不连续Percoll蔗糖密度梯度的从小鼠皮质Synaptoneurosomes
September 17th, 2011
一个准备从小鼠大脑皮质翻译活跃，完好synaptoneurosomes（SNS）的方法来描述。该方法采用一个不连续Percoll蔗糖密度梯度，允许快速制备活跃的SNS。
该程序的总体目标是使用不连续的 peral 蔗糖密度梯度，从小鼠大脑皮层准备到神经区的翻译活性突触。这是通过首先收集和均质化小鼠皮层，然后离心匀浆来实现的。在此之后，将离心匀浆或补充纳粹应用于 preport per 蔗糖梯度。
最后一步是离心并收集突触体组分。最终，western blot 分析和 S 35 蛋氨酸掺入实验表明，突触体部分在突触上富集且具有翻译活性。与离心和过滤等现有方法相比，该技术的主要优点是，利用密度梯度避免了我们的第一次机械损伤，第二次每次调用对其成分中的细胞具有低毒性。
一般来说，刚接触这种方法的人会为这个协议而苦苦挣扎，因为时间起着关键作用。一旦收获了 cortis，应迅速完成该过程。要开始该程序，请按照随附手稿中的说明将相应量的 SIP 添加到 GM 缓冲液中，准备 3、10、15 和 23% 梯度层并充分混合。
将 23 种 15%、10% 和 3% 等渗 perol 溶液中的每一种 2 毫升移液到带盖的贝克曼离心管中，将梯度层倒入。使用 P 1000 移液器，各层之间的界面应清晰可辨，层之间没有混合。使用前将 4 摄氏度的梯度储存至少 20 分钟。
在开始此过程之前，请按照随附手稿中的说明准备其他必要的解决方案。在 P 13 至 P 21 岁时对小鼠实施安乐死，并通过用 70% 乙醇喷洒颈部和头部后部来准备解剖。然后用一把锋利的剪刀剪断颅底的脊髓。
接下来，去除头骨顶部的皮肤。在顶骨和顶骨之间，或在大脑和皮质区域之间横向切开颅骨。之后，沿着矢状缝线从底部切开头骨到鼻子。
在此步骤中，将每个半球拉到一边，小心地去除柔软的顶骨。之后，将刮刀插入小脑上方的大脑以挖出皮层。将其放入冰冷的 GM 缓冲液中，然后再次重复这些程序以收集更多的皮质。
现在用冰冷的 GM 缓冲液冲洗皮质。然后将两个皮质转移到含有 5 毫升冷 GM 缓冲液的玻璃羽绒均质器中。用 5 到 10 次杵 A 轻轻均匀化皮质，松散的杵，然后是 5 到 10 次杵 B，即型杵。
冲程数因单个均质机而异。将匀浆转移到 15 mL 锥形管中。离心 1000 倍。
在 Allegra 6 KR 离心机中，在 4 摄氏度下重力作用 10 分钟，以沉淀细胞碎片和细胞核。每个或蔗糖梯度分层 2 毫升螺旋盐，每个整个皮层一个梯度并盖上管。然后在 Beckman J 2 21 离心机中，将它们放入固定角转子中，以 32， 500 倍重力在 4 摄氏度下离心 5 分钟。
完成后，使用适当的适配器，梯度应产生强 SN 条带移液器，并丢弃 SN 条带上方的溶液。使用玻璃意大利面移液器在 15% 至 23% 界面处移出 SN 带，一个梯度通常得到约 0.9 至 1.1 mL 的 SNS。之后，将其转移到锥形管中并储存在冰上。
然后通过添加 10 倍刺激缓冲液的 10 倍体积来调整 SNS 的盐浓度。可选添加 1000 倍氯化钙，得到最终浓度为 12 阿诺摩尔。接下来，添加 1 毫摩尔 TTX 原液，使终浓度为 1 微摩尔，以抑制非特异性兴奋。
下一步是在适用的下游应用中使用 SNS，例如蛋白质翻译研究。对于其他应用，可以使用 Pierce SDS 页面样品制备试剂盒对 SN 裂解物进行净化或浓缩。SNS 的蛋白质浓度可以使用微量 BCA 蛋白测定试剂盒测定。
下面是六个条带或分数的示例。当小鼠皮层在不连续的 perol 蔗糖梯度上匀浆和分离时，富集的 SNS 包含在 23% 至 15% 界面的波段 5 中，该波段被去除并通过电子显微镜检查。完整的突触小泡以及突触前和突触后元件保留的实例显示在蛋白质印迹中。
突触标志物的增加和 SN 带中杂质的减少来自不连续的每蔗糖梯度，证实了添加谷氨酸后 S 35 蛋氨酸掺入的增加是由于从头蛋白质合成。添加了 40 μmolar anesa mycin a 蛋白质合成抑制剂。该图显示与基础水平相比，在存在 anso mycin （存在或不存在谷氨酸）的情况下，S 35 蛋氨酸掺入显着减少。
因此，不连续的 peral 蔗糖梯度可快速产生高活性和相对纯的 SNS，可用于研究蛋白质翻译。该图显示，来自不连续每个核心蔗糖梯度的带 5 包含最高水平的从头蛋白质合成。通过与孔径减小的过滤器通过一系列过滤器，然后在不连续的每核心蔗糖梯度上离心以进行比较，与从不连续的 perol 蔗糖梯度法制备的 SNS 相比，通过制备的 SNS 制备的 SNS 含有更多的破膜和更少的全 SNS，使用不连续的 peral 蔗糖梯度法制备的 SNS 显示比使用过滤法制备的 SNS 含有更多的从头蛋白质合成活性。
从年轻小鼠制备的 SNS 被证明比老年小鼠具有更大的翻译活性。观看此视频后，您应该对如何通过在摆动桶式转子中离心匀浆的小鼠皮层、在固定角转子中通过每次调用的蔗糖梯度离心上清液，然后收集得到的突触神经区来分离翻译活跃的突触神经区。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概述
本文介绍了一种使用不连续Percoll-蔗糖密度梯度从小鼠脑皮层制备翻译活性突触神经小体（SNs）的方法。该技术允许快速制备，同时最大限度地减少机械损伤和毒性。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 生物化学
背景
- 突触神经小体对于研究突触功能至关重要。
- 传统方法可能会对样品造成机械损伤。
- 密度梯度可以减少对细胞的毒性。
- 了解突触中的翻译活性对神经科学研究至关重要。
研究目的
- 开发一种可靠的方法来分离活性突触神经小体。
- 提高研究用突触体制备的质量。
- 促进对突触功能和机制的进一步研究。
使用的方法
- 小鼠脑皮层的均质化。
- 对均质物进行离心以分离组分。
- 将上清液应用于Percoll-蔗糖梯度。
- 最终离心以收集突触体分数。
主要结果
- Western blot分析确认了该分数的突触富集。
- S35蛋氨酸掺入实验证明了翻译活性。
- 与传统技术相比，该方法有效减少了机械损伤。
- Percoll的低毒性增强了制备中的细胞活力。
结论
- 所描述的方法是制备活性突触神经小体的有效方法。
- 它提供了一个可靠的工具来研究突触机制。
- 未来的研究可以在此技术的基础上进行各种应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Synaptoneurosome isolation enables mechanistic de-risking of synaptic targets by preserving native pre- and postsynaptic protein complexes. This method supports target validation in neuroscience drug discovery by providing translationally active preparations that reflect physiological neurotransmitter handling. The Percoll-sucrose gradient approach reduces artifacts from mechanical damage and cytotoxicity, improving data reliability for lead identification campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by maintaining synaptic vesicle uptake, storage, and release machinery.
- Operational Value: Enables functional target validation through assessment of neurotransmitter dynamics in resealed terminals.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying de novo protein synthesis via S35 methionine incorporation as a translational activity readout.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream assays measuring synaptic protein translation or drug effects on vesicle cycling.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible SN yields (0.9–1.1 mL per cortex) with minimal batch variability due to controlled gradient layering.
- Assay Readiness: Provides scalability for compound screening platforms requiring intact synaptic terminals with preserved pre- and postsynaptic markers.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease-relevant synaptic protein complexes from discovery through preclinical validation of CNS-targeted modulators.
- Mechanistic De-risking: Confirms on-target mechanism by correlating glutamate-stimulated S35 methionine incorporation with synaptic vesicle cycling.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables go/no-go decisions based on translational activity levels, which are higher in juvenile (P13–P21) mouse cortices and reduced by protein synthesis inhibitors like anisomycin.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, where synaptic functional assays inform compound prioritization before preclinical efficacy studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating synaptically enriched fractions validated via western blot for synaptic markers and reduced impurity profiles.
- Screening: Delivers assay-ready SNs with quantitative outputs such as S35 methionine incorporation rates, enabling comparison of compound effects on protein synthesis.
- Analytics: Generates translational activity measurements that help teams compare synaptic functional states across conditions or genetic models.
- Translational Research: Connects to preclinical work by preserving synaptic vesicle cycling machinery relevant to biomarker alignment in neurodegenerative or neuropsychiatric indications.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable cortical SN preparation platform applicable across multiple projects studying synaptic protein translation or drug-induced modulation of vesicle dynamics.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in synaptic target engagement through preserved neurotransmitter uptake, storage, and release capabilities.
- Operational Value: Standardization via isotonic Percoll-sucrose gradients that avoid cytotoxic media and reduce centrifugation steps, enhancing reproducibility.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by quantifying translational activity as a functional synaptic readout, reducing late-stage biological risk in CNS programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of compounds based on dose-dependent effects on SN protein synthesis, supporting capital efficiency in target validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, homogenization technique, and density gradient preparation to avoid cortical damage and ensure sharp layer interfaces.
- Dependent on centrifugation infrastructure (swinging bucket and fixed angle rotors) and temperature control (4°C) throughout processing to maintain SN integrity.
- Necessitates cross-team standardization of homogenization stroke counts and gradient layer volumes to minimize inter-user variability in SN yield and activity.
- Adaptation considerations include adjusting P13–P21 mouse age for developmental synaptic profiles and optimizing TTX concentration (1 µM) to suppress non-specific neuronal excitation in downstream assays.
- Practical limitations include the need for rapid processing post-dissection to prevent activity loss and the requirement for validation via S35 methionine incorporation or western blot to confirm synaptic enrichment.
