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神经科学
0 次观看 • 4:13 分钟 • August 7th, 2025
以麻醉小鼠开始实验，并施用扩瞳剂。
在显微镜下，打开眼睑并轻轻突出眼球，以暴露注射部位。
滴加一滴眼用粘弹剂溶液，然后加盖盖玻片以观察视网膜。
使用细针在角膜-巩膜交界处后方穿刺一个小孔，注意避免损伤血管和晶状体。
通过此预先刺出的小孔，将钝头注射器沿切线方向插入视网膜色素上皮（RPE）附近的视网膜下腔，RPE可支持视网膜神经元。
将携带目的基因的慢病毒载体注射到视网膜下腔。
观察由于液体积聚而形成的视网膜下隆起，以确认病毒载体递送成功。
轻轻闭合眼睑以覆盖注射部位，并让小鼠恢复。
慢病毒通过内吞作用进入视网膜色素上皮细胞（RPE），释放其遗传物质，并将其转化为相应的DNA，该DNA整合到宿主基因组中，从而实现基因表达。
首先，准备一支带有33号钝针头的微升注射器。使用环氧乙烷气体对其进行灭菌。接着，在微量离心管中用PBS配制病毒载体的稀释液，浓度约为每微升100万个滴度单位。现在，在装填注射器时，用溶液反复冲洗数次，以排除注射器内的任何死腔。准备好1.5至2微升待注射液体。
准备好病毒载体注射后，通过腹腔注射替来他明、唑拉西泮和赛拉嗪麻醉成年小鼠。通过检查动物是否缺失反射来确认麻醉效果。确认麻醉成功后，滴加一滴0.5%去氧肾上腺素和0.5%托吡卡胺以扩大瞳孔。现在，在手术显微镜下打开眼睑并突出眼球，以暴露赤道部。将手指置于眼眶边缘外侧，固定眼球于该位置。
接下来，将眼用粘弹性溶液涂抹于角膜表面，并在角膜上放置一个小型圆形盖玻片，以便观察视网膜。然后，在右眼的角膜缘稍偏后方且偏下方，或在左眼的角膜缘稍偏后方且偏上方，使用无菌的30号半针头刺一个小孔。暂时性位置或鼻侧位置的穿刺孔不是理想选择，因为这些位置难以覆盖。
穿刺时，避免触碰角膜缘血管或晶状体，且不可将针头斜面完全插入。
进行视网膜下注射时，将载体注射针以与虹膜平面呈45度角的方向穿过小孔插入。沿标记的路径将针头向后推进至视盘周围区域，穿过玻璃体腔。继续将针头推进至视网膜下腔，直至感到轻微阻力，表明已到达视网膜色素上皮（RPE）层。
切勿以过大的压力穿透巩膜组织，因为针头应置于潜在的视网膜下间隙。若针头以过大的力量刺穿颅骨组织，将无阻力地进入眼外眶内空间。
现在，将病毒载体轻轻注射到视网膜下腔。保持针头静止不动，以防止组织损伤，这一点至关重要。然后，同样轻柔地撤出针头。此时可以松开眼球。应可见视网膜下隆起，表明载体已积聚。最后，轻柔闭合眼睑以覆盖注射部位。穿刺孔将自行闭合。