Name: 高活性酵母核糖体的色谱分离纯化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: 学习使用半胱氨酸电荷SFO连接柱和嘌呤霉素处理快速纯化高活性酵母核糖体的方法。该技术有效分离核糖体与核酸酶和蛋白酶，为生物化学与结构生物学研究提供高质量样品。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢Dinman实验室的所有成员，包括Ashton Belew、Karen Jack、Sharmishtha Musalga、Sergey Sulima、Shivani Reddy和Michael Rhodin，为本项目提供的帮助和建议。本研究得到了美国心脏协会（AHA 0630163N）向AM提供的资助，以及美国国立卫生研究院（5R01 GM058859-12）向JDD提供的资助。JAL的研究得到了2009年美国复苏与再投资法案对母基金的补充资助（3R01GM058859-11S1）的支持。

1. 准备半胱氨酸负载的Sulfolink树脂
<ol>
<li>在室温下准备 Sulfolink 树脂（Pierce）。</li>
<li>将制造商提供的 50% Sulfolink 偶联凝胶浆液共 10 ml 分装至两个 10 ml 塑料离心管中，每管各加入 5 ml。</li>
<li>在 850 × g 条件下短暂离心，小心吸除上清液。</li>
<li>用偶联缓冲液（50 mM Tris，pH 8.5，5 mM EDTA）洗涤凝胶三次：每次加入 5 ml 缓冲液重悬凝胶珠，短暂离心（850 × g），然后用移液器吸除上清液。</li>
<li>向每根管中加入 5 ml 偶联缓冲液中含 50 mM L-半胱氨酸的溶液，在 25°C 下混合浆液 1 小时。</li>
<li>按照步骤 1.4 所述方法洗涤，以去除残留的 L-半胱氨酸。</li>
<li>将凝胶重悬于 10 ml 结合缓冲液 [20 mM HEPES，pH 7.6，5 mM Mg(OAc)2，60 mM NH4Cl，2 mM DTT] 中，并按步骤 1.4 所述方法用 10 ml 结合缓冲液洗涤 3 次，使树脂平衡。将树脂转移至 10 ml 离心柱中，加盖后于 4°C 保存。该树脂的 RNA 结合能力为每毫升约 20 A260 单位。</li>
</ol>
2. 使用半胱氨酸修饰的 Sulfolink 树脂对核糖体进行色谱纯化
注意：如果所使用的菌株存在蛋白酶活性问题，可在后续所有缓冲液中添加蛋白酶抑制剂混合物。
<ol>
<li>所有组分均需保持在冰上，并使用无RNase水和无菌过滤方法配制所有溶液。</li>
<li>在适当培养基中将酵母细胞过夜培养至对数中期（O.D.595 = 0.6 - 1.2）。通过离心收集细胞，用结合缓冲液洗涤1克细胞，并在4°C下以3700 × g离心5分钟。</li>
<li>将细胞重悬于1 ml结合缓冲液中，总体积约为2 ml，加入等体积预冷至4°C的0.5 mm玻璃珠，使用Biospec Mini-bead beater（Bartlesville, OK）进行细胞破碎。根据需要可将样品分装至多个离心管中。</li>
<li>在Beckman-Coulter Optima Max E超速离心机（Fullerton, CA）中以30,000 × g于4°C离心30分钟，去除未破碎的细胞、细胞器及细胞碎片。</li>
<li>使用前立即以1,000 × g离心1分钟，沉淀树脂以去除保存液。每1克细胞使用2 ml树脂。</li>
<li>从30,000 × g离心后的上清液（S30）中小心吸取裂解液，避免接触管顶的脂质层或管底的细胞碎片，并直接加入已活化的Sulfolink悬液中。可通过移除脂层或在吸头进入上清液后从移液枪中推出液体的方式避免脂质污染。</li>
<li>将S30与Sulfolink混合物置于冰上孵育15分钟，期间不进行混匀。</li>
<li>将层析柱放入15 ml锥形管中，以1,000 × g离心1分钟。</li>
<li>将穿流液重新加回到层析柱中，手动混匀后继续在冰上孵育15分钟。</li>
<li>将层析柱再次放入15 ml锥形管中，以1,000 × g离心1分钟，弃去穿流液。</li>
<li>封闭层析柱，加入5 ml结合缓冲液。手动混匀使树脂重悬，打开盖子后以1,000 × g离心1分钟。重复此洗涤步骤两次。</li>
<li>向每个层析柱中加入1.5 ml洗脱缓冲液（20 mM HEPES-KOH, pH 7.6, 10 mM Mg(OAc)2, 500 mM KCl, 2 mM DTT, 0.5 mg/ml肝素），手动混匀悬液，并在冰上孵育2分钟。</li>
<li>将层析柱转移至新的15 ml锥形管中，以1,000 × g离心1分钟，收集洗脱液。重复洗脱一次，使最终合并的样品体积约为3 ml。使用过的树脂可用不含肝素的洗脱缓冲液洗涤，随后用结合缓冲液平衡，并保存于10 ml结合缓冲液中，4°C储存以备后续重复使用。</li>
</ol>
3. 嘌呤霉素处理
注意：去除污染性tRNA的另一种方法是将培养基从富含葡萄糖更换为无葡萄糖培养基，以促进核糖体脱离。然而，这种方法会改变酵母细胞的代谢状态，可能影响核糖体的功能和浓度。
为了去除内源性肽基-tRNA上的核糖体，需用嘌呤霉素进行处理。
<ol>
<li>在室温下，逐滴加入 1M KOH，将 100 mM 嘌呤霉素溶液中和至 pH 7.5。</li>
<li>将中和后的嘌呤霉素溶液加入洗脱液中，使其终浓度约为 1 mM。</li>
<li>加入 100 mM GTP，使其终浓度为 1 mM。</li>
<li>在 30°C 下孵育 30 分钟。</li>
</ol>
4. 通过甘油垫沉降纯化核糖体
<ol>
<li>将1 ml缓冲液（20 mM HEPES，pH 7.6，10 mM Mg(OAc)2，500 mM KCl，2 mM DTT，25%甘油）加入4 ml体积的聚碳酸酯超速离心管中。</li>
<li>将嘌呤霉素处理的洗脱组分轻轻铺加在缓冲液上层，并在4°C下以100,000 × g离心过夜。</li>
<li>从转子中取出离心管，吸除上清液。</li>
<li>用1 ml缓冲液将含有纯化核糖体的沉淀洗涤两次。</li>
<li>用玻璃棒轻轻搅动，将核糖体重新悬浮于100 μl缓冲液中。</li>
<li>搅动后，用封口膜封住管口，在冷室中以中等速度在涡旋振荡器上震荡一小时。</li>
<li>将内容物转移至微量离心管中，在4°C下以最大转速离心5分钟，并将上清液转移至新的离心管中。</li>
<li>重复步骤4.1至4.7，使用2 ml缓冲液，但在步骤4.4和4.5中，使用100 μl储存缓冲液（50 mM HEPES-KOH，pH 7.6，50 mM NH4Cl，5 mM Mg(OAc)2，1 mM DTT，25%甘油）代替缓冲液。</li>
<li>通过分光光度法定量纯化的核糖体（1 A260 = 20 pmol酵母核糖体），并在-80°C保存。通常每1克酵母可获得300–400 pmol核糖体。</li>
</ol>
5. 代表性结果：
图2展示了从本方案三个主要步骤中提取的RNA种类示例。在总细胞裂解液（T）中，rRNA是主要的RNA种类，但也含有大量其他类型的RNA。从Sulfolink柱（SL）纯化的核糖体由于该柱基质对这些RNA种类具有高亲和力，同样含有大量tRNA。对此组分进行嘌呤霉素处理可使肽酰-tRNA上的肽链发生水解，并促进这些tRNA从核糖体上解离。经嘌呤霉素处理后的样品（Pm）不再含有共纯化的tRNA种类，因此代表了完全纯净的核糖体。正如先前报道8，这些核糖体结构完整且具有高度的生物化学活性，是进行深入功能与结构分析的理想底物。
<img src="/files/ftp_upload/3214/3214fig1.jpg" alt="酵母核糖体纯化流程图：OD595生长监测、离心、磺酰树脂结合、嘌呤霉素处理。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 方法流程图。 图示利用半胱氨酸连接的磺酰树脂进行核糖体的层析纯化过程。
<img src="/files/ftp_upload/3214/3214fig2.jpg" alt="RNA凝胶电泳结果，显示25S、18S rRNA、tRNA及其他RNA条带；分子量标记。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 图2. 核糖体制备物的代表性分析。 从全细胞裂解液（T）、Sulfolink纯化的核糖体（SL）以及经嘌呤霉素处理并透过甘油垫沉淀的Sulfolink纯化核糖体（Pm）中提取总RNA组分。M泳道为RNA大小标记物。图中指出了代表25S和18S rRNA、tRNA及其他RNA组分的条带。每个泳道上样量均为2 μg RNA。

<ol><li>Palade, G. E., Siekevitz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+microsomes%3B+an+integrated+morphological+and+biochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophys.+Biochem.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Liver microsomes; an integrated morphological and biochemical study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 2, 171-200 (1956).</li>
<li>Fabry, M., Kalvoda, L., Rychlik, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophobic+interactions+of+Escherichia+coli+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Hydrophobic interactions of Escherichia coli ribosomes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 652, 139-150 (1981).</li>
<li>Jelenc, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+purification+of+highly+active+ribosomes+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Rapid purification of highly active ribosomes from Escherichia coli.</a> Anal. Biochem. 105, 369-374 (1980).</li>
<li>Le goffic, F., Moreau, N., Chevelot, L., Langrene, S., Siegrist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+bacterial+ribosomes+using+chloramphenicol+and+erythromycin+columns%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Purification of bacterial ribosomes using chloramphenicol and erythromycin columns.</a> Biochimie. 62, 69-77 (1980).</li>
<li>Meskauskas, A., Petrov, A. N., Dinman, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+functionally+important+amino+acids+of+ribosomal+protein+L3+by+saturation+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of functionally important amino acids of ribosomal protein L3 by saturation mutagenesis.</a> Mol. Cell Biol. 25, 10863-10874 (2005).</li>
<li>Algire, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+reconstituted+yeast+translation+initiation+system%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system.</a> RNA. 8, 382-397 (2002).</li>
<li>Maguire, B. A., Wondrack, L. M., Contillo, L. G., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+chromatography+system+to+isolate+active+ribosomes+from+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A novel chromatography system to isolate active ribosomes from pathogenic bacteria.</a> RNA. 14, 188-195 (2008).</li>
<li>Leshin, J. A., Rakauskaite, R., Dinman, J. D., Meskauskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+purity%2C+activity+and+structural+integrity+of+yeast+ribosomes+purified+using+a+general+chromatographic+method%5BTitle%5D)+AND+%22RNA.+Biol%22%5BJournal%5D)">Enhanced purity, activity and structural integrity of yeast ribosomes purified using a general chromatographic method.</a> RNA. Biol. 7, 354-360 (2010).</li>
<li>Triana, F., Nierhaus, K. H., Chakraburtty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+RNA+binding+to+80S+ribosomes+from+yeast%3A+evidence+for+three+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Mol.+Biol.+Int%22%5BJournal%5D)">Transfer RNA binding to 80S ribosomes from yeast: evidence for three sites.</a> Biochem. Mol. Biol. Int. 33, 909-915 (1994).</li>
<li>Azzam, M. E., Algranati, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+puromycin+action%3A+fate+of+ribosomes+after+release+of+nascent+protein+chains+from+polysomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 70, 3866-3869 (1973).</li>
<li>Nathans, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Puromuycin+inhibition+of+protein+synthesis%3A+incorporation+of+puromycin+into+peptide+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Puromuycin inhibition of protein synthesis: incorporation of puromycin into peptide chains.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 51, 585-592 (1964).</li>
<li>Rabinovitz, M., Fisher, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dissociative+effect+of+puromycin+on+the+pathway+of+protein+synthesis+by+Ehrlich+ascites+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A dissociative effect of puromycin on the pathway of protein synthesis by Ehrlich ascites tumor cells.</a> J. Biol. Chem. 237, 477-481 (1962).</li>
<li>Allen, D. W., Zamecnik, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+puromycin+on+rabbit+reticulocyte+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The effect of puromycin on rabbit reticulocyte ribosomes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 55, 865-874 (1962).</li>
<li>Yarmolinsky, M. B., Haba, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+by+puromycin+of+amino+acid+incorporation+into+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Inhibition by puromycin of amino acid incorporation into protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 45, 1721-1729 (1959).</li>
<li>Becker-Ursic, D., Davies, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+phosphorylation+of+ribosomal+proteins+by+protein+kinases+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro phosphorylation of ribosomal proteins by protein kinases from Saccharomyces cerevisiae.</a> Biochemistry. 15, 2289-2296 (1976).</li>
</ol>

未声明利益冲突。

核糖体纯化方案基本包括裂解细胞、通过低速离心收集细胞质组分，然后通过高速离心沉淀核糖体1。尽管已有少数新方法用于纯化细菌核糖体，但真核生物核糖体的纯化尚未取得类似进展2-4。尽管多年来已增加了一些步骤，例如盐洗涤和甘油垫层离心（例如参见5），但酵母核糖体的生化与结构研究仍受到其在纯化过程中易被内源性降解酶破坏的限制，这很可能是因为在超速离心步骤中核糖体长时间暴露于这类酶所致6。
传统方案存在的主要问题是核糖体在纯化过程中会共纯化蛋白酶和核酸酶，导致核糖体在纯化期间发生降解，从而降低具有生物化学活性的核糖体得率。在致病菌的临床分离株中，蛋白酶和核酸酶含量较高，这促使研究人员开发了一种使用半胱氨酸偶联的Sulfolink树脂进行核糖体纯化的层析方法7。采用该方法分离的细菌核糖体所获得的rRNA和蛋白质显示出更低程度的降解，且纯化后的核糖体结合红霉素和合成蛋白质的能力显著增强。核糖体与Sulfolink树脂结合的具体化学机制尚不明确，但据推测可能涉及疏水相互作用7</s...

<table><tbody><tr><td>硫联偶联树脂</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>20402</td><td></td></tr><tr><td>Mini bead-beater 16</td><td>Biospec Products</td><td>607</td><td></td></tr><tr><td>Optima Max E 超速离心机</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Legend RT</td><td>Sorvall, Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 mm 玻璃珠</td><td>Biospec Products</td><td>11079105</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>54459</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60128</td><td></td></tr><tr><td>Mg(OAc)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7255</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Fermentas</td><td>R0461</td><td></td></tr></tbody></table>

高活性酵母核糖体的层析纯化

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

与真细菌和古菌核糖体相比，真核生物核糖体更不稳定，这给研究人员带来了显著挑战。尤其令人困扰的是，细胞裂解会释放大量蛋白酶和核酸酶，这些酶可降解核糖体。因此，必须尽快将核糖体与这些酶分离开来。然而，传统的差速超速离心方法会使核糖体暴露于这些酶的作用下过长时间，从而影响其结构完整性和功能活性。为解决这一问题，我们采用了一种使用半胱氨酸负载的Sulfolink树脂的层析方法。该方法操作简便、快速，可显著减少共纯化的蛋白水解和核酸水解活性，获得高产量的完整且生化活性高的酵母核糖体。我们建议该方法也可适用于哺乳动物核糖体。该方法的简便性以及通过层析纯化所获得的核糖体更高的纯度和活性，代表了真核生物核糖体研究领域的一项重要技术进步。

通过传统方法纯化的真核生物核糖体常因共纯化出的核酸酶和蛋白酶污染，从而对后续的生化与结构分析产生不利影响。本研究采用酵母核糖体作为模型系统，使用一种快速且简单的色谱纯化方法来解决这一问题。

与原核生物和古菌核糖体相比，真核生物核糖体更不稳定，这给研究人员带来了重大挑战。

本实验的总体目标是纯化完整且高活性的酵母核糖体。首先通过裂解细胞，并利用高速离心澄清裂解液。随后使用带有半胱氨酸修饰的SFO-link柱对核糖体进行纯化，以获得S 30组分。随后通过嘌呤霉素处理去除污染的tRNA，作为最终的纯化步骤。核糖体经过高速超速离心。该技术相较于现有的超速离心纯化等方法的主要优势在于，使用磺胺连接柱能够快速将核糖体与污染的核酸外切酶和蛋白酶分离。此外，嘌呤霉素处理步骤可将核糖体与tRNA等污染性RNA种类分离。这些步骤可确保大量制备出高活性、完整且纯化的核糖体，用于生化与结构研究。本实验操作将由我实验室的博士后研究员Jonathan Leschen进行示范。首先，取制造商提供的50%硫酸酯连接凝胶悬液，用移液器将其分别加入两个10毫升塑料离心管中，每管加入5毫升。将离心管短暂在850 × g条件下离心后，小心吸去上清液。用偶联缓冲液洗涤凝胶三次：每次将凝胶颗粒重悬于5毫升缓冲液中，随后短暂离心（850 × g），并通过移液器吸除上清液。洗涤树脂后，向每根离心管中加入5毫升含50毫摩尔/升L-半胱氨酸的偶联缓冲液。在25摄氏度下将悬浮液搅拌一小时。然后用偶联缓冲液单独洗涤树脂三次，以去除残留的L-半胱氨酸。接下来，将凝胶重悬于10毫升结合缓冲液中，并用该缓冲液洗涤三次以平衡树脂。最后，将树脂倒入一个10毫升离心柱中并盖上盖子。该树脂可在4°C下保存，在核糖体的层析纯化过程中，其树脂载量约为每毫升20至60个单位。使用带有半胱氨酸的磺酰基连接树脂。所有组分均需保持在冰上，并使用无RNA酶的水和无菌过滤方法配制所有溶液。在适当的培养基中将酵母细胞过夜培养至对数中期。离心收集细胞后，用结合缓冲液洗涤一克细胞，再次离心，然后将细胞重悬于一毫升结合缓冲液中，总体积约为两毫升。使用预冷至 4°C 的 0.5 毫米玻璃珠（体积与样品相等）以及微型珠磨仪裂解细胞。在超速离心机中以 30,000 × g 离心 30 分钟，去除未破裂的细胞、细胞器和细胞碎片。同时，在使用前立即以 1000 × g 离心 1 分钟收集树脂，以去除保存液。每克细胞使用2毫升树脂。样品经超速离心后，从30,000 × g离心所得的上清液（称为S30）中去除细胞裂解物。操作时需注意尽量避免脂质层（位于管顶）或细胞碎片（位于管底）的污染。将上清液直接转移至含有带电SFO连接液的混合液中。将S 30 SFO连接混合物置于冰上孵育15分钟。将层析柱放入50毫升锥形管中，以1000 × g离心1分钟，将穿流组分重新转移回层析柱中，盖上柱帽并倒置混匀。将样品继续在冰上孵育15分钟。然后将柱子放入50毫升锥形管中，在1000 × g条件下离心1分钟，弃去穿流液。加入5毫升结合缓冲液后，盖上柱子的盖子并颠倒混匀，直至充分重悬。取下盖子，将各层析柱在1000 × g离心1分钟。重复此洗涤步骤额外两次。随后，向每个层析柱中加入1.5 mL洗脱缓冲液。用手轻轻混匀悬浮液，并在冰上孵育两分钟。最后一步，将层析柱放入新的50毫升锥形管中，在1000 × g条件下离心一分钟，收集流出液，并重复洗脱步骤一次，使最终合并的样品体积约为三毫升。为了去除核糖体上结合的内源性肽链，需使用嘌呤霉素对T-R-N-A-A进行处理。首先，通过逐滴加入1摩尔氢氧化钾溶液，将100毫摩尔的嘌呤霉素溶液中和至pH 7.5。加入室温。将中和后的嘌呤霉素溶液加入洗脱液中，使其终浓度约为1毫摩尔。然后加入100毫摩尔的GTP，使其终浓度为1毫摩尔。在30摄氏度下孵育混合物30分钟。孵育结束后，取1毫升垫层缓冲液加入4毫升体积的聚碳酸酯超速离心管中。将嘌呤霉素处理的洗脱组分轻轻铺在缓冲液垫上，于100,000 × g离心过夜。吸除上清液后，用1 mL缓冲液缓冲液洗涤含有纯化核糖体的沉淀。再用第二份1 mL缓冲液缓冲液重复洗涤一次。然后，Reza 使用玻璃棒轻柔地将核糖体悬浮于 100 微升缓冲液中。接着，用帕兰膜封住管口，在低温室温下以中等速度振荡。振荡一小时后，将内容物转移至微量离心管中，在 4°C 条件下以最大转速离心五分钟。将上清液转移至新的离心管中。在超速离心管中，将上清液铺加到2 mL垫层缓冲液上方，随后在100,000 × g条件下离心过夜。第二天，从离心机转子中取出离心管，并吸走上清液。采用上述方法，用储存缓冲液洗涤沉淀并重新悬浮核糖体。最后，在 -80 摄氏度保存前，通过光谱光度法对纯化的核糖体进行定量。此处展示的是从本实验方案三个主要步骤中提取的RNA种类示例，包括总细胞裂解液、sulf olink纯化的核糖体，以及经嘌呤霉素处理并穿过甘油垫沉淀的sufu link纯化核糖体。同时显示了RNA大小标记物，我们的RNA是总细胞裂解液中存在的主要RNA种类，其中还包含大量其他种类的RNA。从磺酰连接柱纯化的核糖体含有大量tRNA，这是由于柱基质对这些物质具有高亲和力。用匹罗霉素处理该组分可导致肽基-tRNA上的肽链水解，并促进这些物质从核糖体上解离。经匹罗霉素处理的纯净样品不再共纯化tRNA组分，因此代表了完全纯净的核糖体。如先前报道，这些核糖体结构高度完整且具有生物化学活性，是进行详细功能和结构分析的理想底物。通过该步骤后，可进一步采用其他方法，如核糖体配体结合检测和结构分析，以回答更多问题，例如真核生物核糖体的生物化学与生物物理特性是什么。

chromatographic-purification-of-highly-active-yeast-ribosomes

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

高活性酵母核糖体的色谱分离纯化

我们介绍一种从酵母Saccharomyces...

从酵母细胞中纯化线粒体

本文介绍了一种从真核细胞中提取正在翻译的核糖体的实验方案。提取后，通过蔗糖梯度分级分离将核糖体分为单体核糖体和多聚核糖体，从而实现对不同核糖体群体的分析。因此，该方法是研究翻译调控的金标准。...

真核生物多聚核糖体图谱分析

来源：Becker, B., et al．一种基于荧光报告基因的简易检测方法，用于鉴定酵母中蓖麻毒素A链（RTA）转运所需的细胞组分．J. Vis. Exp.

一种用于纯化重组细菌蛋白的亲和层析技术

制备高质量的酵母细胞提取物是分析单个蛋白质或整个蛋白质组的必要第一步。本文介绍一种快速、高效且可靠的酿酒酵母细胞匀浆方案，该方案经过优化，可有效保持蛋白质功能、相互作用以及翻译后修饰。...

用于研究功能、相互作用及翻译后修饰的芽殖酵母蛋白质提取与纯化

本文描述了在芽殖酵母Saccharomyces...

一种可检测出芽酵母着丝粒蛋白 Ndc10 和 Ndc80 发生 SUMO 化与泛素化修饰的蛋白质纯化技术

本文介绍了一种利用酵母表达、增溶并纯化多种与SLC4转运蛋白家族具有同源性的真核生物硼酸盐转运蛋白的实验方案。我们还描述了一种化学交联实验，用于检测纯化的同源多聚体蛋白的多聚化组装情况。这些方案可适用于其他难处理的膜蛋白。...

真核生物硼酸盐转运蛋白的表达、增溶与纯化

本文介绍了一种在酵母中表达、纯化SNX-BAR异源二聚体并进行脂质体结合的实验流程。...

酿酒酵母SNX-BAR异源二聚体的表达、纯化及脂质体结合

我们介绍一种使用标准实验室设备快速且经济高效地制备重组型PURE无细胞转录-翻译系统的方法。...

OnePot PURE 无细胞体系

我们介绍一种利用甲醛交联在活酵母和哺乳动物细胞中快速稳定翻译（蛋白质生物合成）复合物的技术。该方法能够解析瞬时中间产物以及动态的RNA:蛋白质相互作用。交联后的复合物可用于多种下游应用，例如基于深度测序的分析方法、显微镜观察和质谱分析。...

快速 体内 真核细胞中翻译复合物的固定与分离

共翻译相互作用在新生肽链的修饰、定位、折叠和组装过程中起着关键作用。本文介绍了选择性核糖体谱分析法，这是一种用于在模式真核生物Saccharomyces...

通过选择性核糖体谱分析全局鉴定共翻译相互作用网络

本方案介绍了一种基于位点特异性重组的基因座特异性染色质分离方法，用于从酿酒酵母（Saccharomyces...

单拷贝基因座染色质纯化技术在 Saccharomyces cerevisiae 中的应用

学习使用半胱氨酸电荷SFO连接柱和嘌呤霉素处理快速纯化高活性酵母核糖体的方法。该技术有效分离核糖体与核酸酶和蛋白酶，为生物化学与结构生物学研究提供高质量样品。

高活性酵母核糖体的层析纯化

探索更多视频