帕金森病单侧损毁6-OHDA小鼠模型的建立

本实验的总体目标是建立一种帕金森病小鼠模型。首先准备手术所需的药物，随后组装手术器械，接着进行单侧六羟基多巴胺损毁手术，并在术后给予适当护理。

六只经羟基多巴胺损毁的动物可用于行为学实验。最终结果表明，单侧内侧前脑束的多巴胺耗竭程度超过95%。该操作过程中，个体必须注意的两个最重要方面，首先是适当的术后护理，以确保动物存活。

其次，注意准备用于输注6-羟基多巴胺的设备，以确保神经毒素的递送完整。开始此操作前，先将手术器械在高压灭菌器中灭菌。接着，使用异丙醇彻底清洁所有台面和设备表面。

然后通过在笼底铺上纸巾来准备术后小鼠恢复笼。将笼子放置在加热灯下或加热垫上，以设置麻醉推车。确保氧气进气管已连接并打开，且异氟烷储液罐已完全装满。

随后，将氧气流速设置为1%，异氟烷浓度设置为2%至4%。下一步是组装输注装置。将一个RN金属螺母旋入峰流管的一端，接着装入峰流杯雌接头。然后安装标准PFA雌接头，调整两个雌接头的方向，使标准PFA雌接头上的锥形部分能够顺利插入峰流杯雌接头的对应配合部位。

然后将配对好的峰形杯和标准PFA进样管分别插入双小接头RN连接器的两端，并拧紧双小接头RN连接器另一端的RN金属螺母。插入一支33号注射针，将针头穿过其中一个RN金属螺母并拧紧固定。

确保33号针头与双小接头RN连接器呈180度角。然后在峰流路管的另一端，先旋入一个RN金属螺母，随后接上峰杯feral。接着将标准PFA feral插入第二个双小接头RN连接器的较深凹槽内，并拧紧RN金属螺母以固定连接。

接下来，在第二个小型双路RN连接器的另一端，将诱饵插入小型RN接头，并拧紧诱饵的RN金属螺母，以确保连接牢固。输注装置的安装现已完成。另一个准备步骤是为输注装置预充液体。

首先，用无菌水填充250微升和1微升的Hamilton注射器，确保其中无气泡。然后将250微升注射器连接到诱饵适配器上，并推动250微升注射器的推杆，使水从管路另一端的33号注射针头中释放出来。

在将250微升注射器从液路接头中拔出的同时，继续推动水流通过系统。在液路接头末端留有一小滴水珠后，按压1微升注射器的推杆，直至排出一小滴水珠。随后，小心地将1微升注射器插入液路接头中。

确保1微升注射器上的水珠与引物适配器上的水珠相接触。然后将1微升注射器完全插入引物适配器中，并确保小型双联RN接头耦合器内无气泡。现在将灌注装置固定到立体定位仪框架上，并将输注泵夹住带有33号注射针头的小型双联RN接头耦合器，固定于立体定位仪框架的操纵臂上。

然后将1 µL微量注射器固定到灌流泵上。之后设置输液泵，使灌流速率为0.1 µL/min，在手术前30分钟开始灌流。称量动物并记录其体重。

通过腹腔注射给予小鼠2.5毫克/毫升盐酸多巴胺与0.5毫克/毫升盐酸帕林混合液，剂量为10毫升/千克。随后，在耳杆和门齿杆下方放置一个温热的加热板，以维持动物在手术期间的体温，并使动物保持理想高度，以适配立体定位仪的耳杆和门齿杆。在注射盐酸多巴胺与盐酸帕林混合液后15分钟开始操作。

将小鼠放入密闭的麻醉仓中，通过吸入异氟烷进行麻醉。当小鼠对后肢夹捏无反应且无眨眼反射时，表明麻醉已达到充分程度。

然后剃除小鼠头部顶部的毛发。此时将小鼠置于立体定位仪中，将门齿杆插入其口腔，并在其面部放置麻醉面罩。

然后调节异氟烷的流速。使用棉球将局部镇痛药利多卡因直接涂抹于皮肤。调节门齿杆和耳棒，使颅骨顶部处于水平位置。

然后用碘伏溶液对皮肤进行消毒。接着插入耳棒。当头部完全放平且无法向任何方向移动时，表明耳棒已插入到位。

随后，使用手术刀片沿头部中线切开，并将皮肤拉开。用纱布垫擦干颅骨表面。将1微升注射器的推杆向下推，然后将33号注射针插入含有15毫克/毫升溶液的1毫升试管中。

用锡箔纸包裹六羟基多巴胺溶液。在保持33号注射针浸没于六羟基多巴胺溶液中的同时，缓慢回拉针栓。接着，将注射针尖推进至B区黑质致密部（bgma），并释放少量六羟基多巴胺溶液，以形成一个小液滴。

然后缓慢降低注射针尖至枕骨大孔。当珠子接触到小脑延髓池时，停止推进针头并记录这些坐标。将注射针在背侧方向回撤两毫米，并沿矢状缝向头侧方向移动至人字缝。

当针头位于Lambda点上方时，从注射针中挤出少量6-羟基多巴胺溶液，形成一个小液滴。然后缓慢降低针尖至Lambda点。当液滴接触Lambda点时，停止下针，并记录这些坐标。

BMA 和 Lambda 的内外侧坐标以及背腹侧坐标应保持一致。若不一致，需相应调整门齿杆。对于前后坐标以及内外侧坐标的耳杆，将针头移至注射坐标位置。

在相对于rema后1.2毫米、内侧1.1毫米处，从注射针头中挤出少量溶液，形成一个小液滴。将该小液滴降至颅骨表面，以标记钻孔位置。随后撤回针头，使用25号针头在颅骨上钻孔。

将注射针回至注射坐标位置，并沿背腹方向插入负五毫米。随后，以每分钟0.1微升的速度，向内侧前脑束单侧注入0.2微升的6-羟基多巴胺或溶剂对照物。完成6-羟基多巴胺或溶剂对照物注射后，将针头留置原位五分钟，以允许其从注射部位充分扩散。

此后，缓慢撤出针头，用三针缝合头皮切口，然后皮下注射1毫升乳酸林格液。最后，将动物从立体定位仪上取下，放入恢复笼中，直至意识恢复。在六羟多巴胺损毁手术后15至21天。

当神经毒素引起的细胞死亡达到完全程度时，可通过测量自发的360度旋转行为来评估六羟基多巴胺损毁的效果。在此行为评估中，六羟基多巴胺诱导的多巴胺耗竭超过95%的小鼠，其同侧（IP）翻转旋转次数显著多于部分六羟基多巴胺损毁及假手术组小鼠。通过将每只小鼠的纹状体（SAL）多巴胺水平与其自发同侧翻转旋转百分比进行相关性分析发现，表现出70%或更高同侧翻转旋转率并接受六羟基多巴胺损毁的小鼠，其纹状体多巴胺损失超过95%。

观看本视频后，您应能充分掌握如何在小鼠中有效实施立体定位及脑室内灌注控制的6-羟基多巴胺损毁操作，该方法可实现超过95%的多巴胺耗竭水平。此外，您还应理解如何对小鼠进行帕金森样行为学评估。