在细菌粘附的研究剪应力

该视频演示了一种研究纯粹压力对细菌粘附影响的程序。在严重感染细菌病原体（如 nice sirium mens）期间，病原体到达那里的血液，附着在宿主细胞上并定植，同时在增殖后血液流动的机械应力下，一些细菌分离并定植于新部位，循环再次开始研究影响细菌粘附的因素宿主细胞。将内皮细胞引入一次性流动室和培养物中，以使细胞达到汇合。

添加荧光细菌并通过实验控制纯粹的压力。使用注射泵在显微镜下跟踪细菌与宿主细胞的粘附和增殖。分析所得视频以确定剪切应力对内皮定植过程的影响。

该程序对于研究 NICE 脑膜炎的发病机制非常有用，但它也可用于在整个发病过程中受到剪切应力的其他细菌。这种技术可能有点棘手，尤其是在将气泡引入系统时，这可能是一个问题。所以今天演示该程序的将是 Mega，一位在我实验室工作的博士生。

本视频中描述的实验是使用在 IDI 微载玻片 6 0.4 中培养的细胞进行的，该载玻片由一个一次性无菌塑料载玻片组成，该载玻片包含六个 17 毫米长和 3.8 毫米宽、深 0.4 毫米的通道。每个通道都有两个带诱饵适配器的接入端口，每端一个用于引入 uve 细胞，将 30 微升 1 乘以 10 的 1 倍移液到六个细胞悬液中每个通道中。在载玻片上，让细胞在 37 度和 5% CO2 气氛的加湿培养箱中粘附 3 小时。

孵育后，再添加 120 μL 的 endo SFM。为了填充孔，细胞应在约 20 小时后形成亚汇合单层。同时，将表达良好 sirium 脑膜炎的 GFP 划线到 APL 上，该细菌是一种人类病原体。

因此，对这种微生物的任何作都应在二级安全设施中进行，训练有素的人员穿着长袍和手套，建议人员针对所使用的血清组进行疫苗接种。这是菌株 8 0 1 3。表达 GFP 是在 IPDG 诱导启动子条纹的控制下培养的。

GC BPL 上的细菌含有 Kellogg 补充剂和每毫升 5 微克氯霉素，在 37 摄氏度的 5% CO2 培养箱中放置 16 小时。一旦哺乳动物细胞培养物建立起来，细菌就会被添加到通道中的宿主细胞中。在准备流式测定时，使用接种环从培养皿中收集细菌，将它们转移到含有预热、补充内皮细胞培养物的 50 毫升锥形管中。

中等 Endo SFM。通过将样品在相同介质中稀释至最终体积为 5 毫升，将光密度调整至 OD 600 为 0.05。为了诱导 GFP 表达，添加 IPTG 至终浓度为 1 毫摩尔，并将培养物孵育 120 分钟。

在 37 摄氏度的加湿 5% CO2 培养箱中轻轻摇晃。将带有先前制备的培养内皮细胞的微载玻片放在配备加热平台的倒置显微镜的载物台上，以将样品温度保持在 37 摄氏度。将补充有 2% FBS 的预热 endo SFM 倒入无菌玻璃扬声器中，然后拉动柱塞填充 50 毫升注射器。

入口管连接到三通旋塞。接下来，将入口管连接到注射器上，并按下柱塞以将培养基填充到管中。使用提供的直角连接器小心地将入口管的另一端连接到微滑轨上。

避免将空气引入腔室。将注射器放在泵上，然后将切开的 1 毫升注射器放在旋塞阀上的可用插槽上作为储液槽。然后将出口管固定在通道的另一端，并通过将注射器柱塞推至距腔室出口约 1 厘米的距离，小心地将介质填充到通道中。

测量细菌 OD 600 并调整至 0.15 并像以前一样将含有 2% FBS 的 endo SFM 剧烈涡旋样品以破坏细菌聚集体。接下来，使用一次性塑料牧场移液器将 100 微升补充有 2% FBS 培养基的 endos fm 转移到储液器中。然后从涡旋溶液的顶部吸出 100 微升细菌溶液，并将其添加到储液槽中。

小心地转动旋塞阀，将细菌注入微载玻片的腔室，以便在受控的铧口应力水平下进行粘附。使用注射泵以每小时 3.5 毫升的速度将含有 2% FBS 的 endo SFM 引入腔室，持续 15 分钟。此视频加速了 60 倍。

实际持续时间为 10 分钟。在此步骤之后，还可以评估细菌在各种条件下与宿主细胞的粘附和分离，并在视频的后续部分中进行描述。为了量化单个细菌与宿主细胞的初始粘附，在液体仍在循环的情况动 15 分钟后开始采集图像，采集 10 个随机场的图像以确定每个成像场的贴壁细菌的平均数量。

首先打开 Image Day 软件，然后打开要分析的图像。首先单击 image 菜单并选择。调整亮度对比度。

通过移动光标来调整强度级别，优化背景上单个粘附荧光细菌的可视化。然后在插件中，analyze cell counter 菜单。打开细胞计数器工具，初始化图像，选择对象，键入并单击每个单独的细菌。

细菌总数将显示在窗口中。最后，将每个图像的数据导出到 excel 并平均以量化每个字段的粘附细菌的平均数量，以测量单个粘附细菌对流动的阻力。在最初的 15 分钟流动程序后，注射泵设置为产生每平方厘米 3 到 100 角硬币的剪切应力，持续 5 分钟。

在五分钟结束时，停止流式流动，像以前一样采集和分析 10 个随机场，以确定每个场剩余细菌的平均数量。在最初的 15 分钟流动后，将注射泵调整到选定的剪切应力。让它流动几个小时，以每 5 分钟一帧的速度记录图像。

理想情况下，如果显微镜配备了电动 XY 平台，则可以跟踪多个位置。视频显微镜检查后，通过关闭注射泵来停止纯粹的压力。立即采集 2 到 3 张其他图像，然后在软件上停止图像采集序列。

在这里可以看到细菌增殖的一个例子。最后，要分析图像，请使用 image J 的 image adjust threshold （图像调整阈值） 菜单将图像转换为二进制图像。然后在 set measurement 下的 analyze（分析）菜单中，选择面积测量。

然后使用 analyze particle （分析粒子） 工具自动确定菌落的大小。5 到 7 小时后，细胞表面会形成大的微集落，无论此时是否保持流动。为了首先测量微菌落对流动的阻力，通过相差获取两个细胞的两到三个图像，通过 GFP 荧光获取细菌的两到三个图像。

施加高剪切应力 5 分钟，每 5 秒拍摄一帧荧光图像。通过关闭注射泵来停止剪切应力。采集两到三个额外的图像，然后在软件上停止图像采集序列，以收集用于铺板分析的培养基。

首先，拆下出口管路，注意避免排空通道。加入预热的新鲜培养基以填充孔。然后拆下入口管，用微量移液管收集剩余的培养基，并转移到微量离心管中要去除通道中剩余的培养基，向通道中加入 120 μL 的 PBS 中，冲洗微量载玻片两次。

倾斜载玻片两次并丢弃培养基。要收集受感染的细胞，将 50 微升 tripsin EDTA 添加到微玻片中，并在 37 度下孵育 5 分钟以将它们从通道中分离出来，并将该分离的样品与上一步收集的悬浮液混合。在 PBS 板中进行连续稀释后，将 10 微升馏分放在 GCB 农用板上，一式三份，在 37 摄氏度、5% CO2 下孵育过夜。

第二天确定菌落形成单位的数量，以评估细菌从微菌落中的分离。像以前一样，以每小时 3.5 毫升的低流速感染流动室中的细胞，30 分钟后，将流速增加到每分钟 5 毫升，持续 2 分钟，然后恢复到每小时 3.5 毫升的低流速，让感染持续 2 小时。然后，每小时收集一滴从流动室流出的培养基放入微量离心管中，持续 4 小时。

收集完所有样品后，像以前一样确定菌落形成单位的数量。这是细菌在细胞表面初始粘附的图形表示。图表上的每一条线都表示给定字段中绑定的细菌数作为时间的函数。

指示三个场的值，以给出在细胞表面增殖后预期的场间变化的概念。通过将剪切应力水平提高到每平方厘米 10 丁来测试微菌落的机械阻力，但是虽然类型微菌落具有抗性，但由丸 v 突变体形成的微菌落会因流量增加而被破坏。该突变体在微集落下无法诱导质膜的重塑，因此在发育后对增加的剪切应力更加敏感。

这项技术为传染病领域的其他研究人员探索剪切应力对各种病原体与不同细胞类型相互作用的影响铺平了道路。不要忘记，与人类病原体一起工作可能非常危险，在执行此程序时应始终采取预防措施，例如二级或三级措施。