Name: 在细菌粘附的研究剪应力 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: 了解利用流动腔模拟血流剪切应力研究细菌对内皮细胞粘附的实验方法。该技术可定量分析Neisseria meningitidis等病原体的初始粘附率及定植动态，为感染病理机制研究提供可靠框架。

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作者感谢Emilie Mairey和Emmanuel Donnadieu在本实验方案初始建立过程中提供的帮助。

1. 人类宿主细胞与细菌培养
<ol>
	<li>将 HUVECs 在 37°C、含 5% (v/v) CO2 的湿润培养箱中培养，传代次数控制在 1 至 9 代之间。当细胞融合度接近 80% 时，使用胰蛋白酶/EDTA 进行消化传代，用于在 75 cm2 培养瓶中维持培养，或在一次性流动小室（μ-Slides VI）中进行实验培养。</li>
	<li>吸除待传代培养瓶中的培养基，用 10 ml PBS 洗涤细胞，吸除 PBS 后加入 1.5 ml 胰蛋白酶/EDTA。将细胞置于细胞培养箱中，在 37°C 下孵育 5 分钟，使细胞脱落。</li>
	<li>用 10 ml 细胞培养基收集细胞至 15 ml 离心管中。在室温下以 200 g 离心 5 分钟，收集细胞沉淀。将细胞重悬于 4 ml 含 10% (v/v) FBS 的 Endo-SFM 培养基中，并按照制造商说明，使用 Malassez 计数板进行细胞计数。</li>
	<li>将 30 μl 含 1×106 个 HUVEC 细胞/ml 的细胞悬液加入通道中（共 3×104 个细胞），在 37°C、含 5% (v/v) CO2 的湿润培养箱中孵育 3 小时，使细胞贴壁。随后加入额外的 120 μl Endo-SFM 培养基以充满小室。细胞应形成亚融合的单层（图 2）。</li>
	<li>在含 Kellogg 补充剂和 5 μg/ml 氯霉素的 GCB 琼脂平板上，于 37°C、含 5% (v/v) CO2 的湿润环境中培养表达 GFP 的 N. meningitidis（本实验中为在 IPTG 诱导型启动子调控下表达 GFP 的菌株 8013），培养 16 小时。</li>
</ol>
2. 细菌个体对宿主细胞的初始黏附
<ol>
	<li>将GCB琼脂平板上培养的细菌用预热的含10% (v/v) 胎牛血清（FBS）的Endo-SFM调整至OD600为0.05，并在37°C、含5% (v/v) CO2的湿润环境中，以130 rpm轻柔振荡培养120分钟。在整个培养期间，通过向培养基中添加1 mM IPTG诱导GFP表达。</li>
	<li>将一次性μ-Slide放置在配有加热平台的倒置显微镜载物台上，以维持样品温度在37°C。</li>
	<li>将预热的含2% (v/v) FBS的Endo-SFM倒入无菌玻璃烧杯中，并用该培养基填充无菌50 ml注射器。将“入口”管路连接至注射器，并注入培养基将其充满。</li>
	<li>小心地将“入口”管路连接至μ-Slide，避免将空气引入腔室。随后，将“出口”管路连接至另一端，并缓慢用培养基填充通道，直至距离腔室“出口”约1 cm处。</li>
	<li>测定细菌的OD600，并用含2% (v/v) FBS的Endo-SFM调整至0.15。为观察单个细菌，需通过剧烈涡旋处理细菌样品以彻底分散任何聚集体。</li>
	<li>向储液池中加入100 μl含2% (v/v) FBS的Endo-SFM培养基，并从涡旋后溶液的上层取100 μl细菌悬液加入，以避免取到残留的细菌聚集体。</li>
	<li>通过旋转旋塞阀，将200 μl体积的细菌悬液小心注入μ-Slide腔室中。</li>
	<li>使用注射泵将维持在37°C的含2% (v/v) FBS的Endo-SFM以0.044 dynes/cm2的剪切应力（适用于细菌黏附）引入腔室，持续15分钟。</li>
</ol>
例如，参见视频1或图3。完成此步骤后，可转至第3、4或6节。
3. 单个细菌对宿主细胞初始黏附的定量分析
<ol>
	<li>初始黏附15分钟后，在液体仍在循环时随机获取十个视野的图像。</li>
	<li>使用 ImageJ 软件8分析所获取的图像，以计算每个视野中平均黏附的细菌数量。具体操作如下：首先，在“图像”菜单中的“阈值”（Threshold）窗口对每张图像进行阈值处理，以突出显示单个黏附的荧光细菌，同时尽量减少细胞背景的干扰。然后，使用插件“Cell Counter”（<a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html">http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html</a>）对每个细菌进行计数。将每幅图像的数据记录在 Excel 电子表格中，并计算平均值，以定量每个视野中黏附细菌的平均数量。</li>
</ol>
4. 测定单个细菌黏附于宿主细胞后对流动的抗性
<ol>
	<li>设置注射泵系统，以产生 3 至 100 dynes/cm2 的剪切应力，持续 5 分钟。</li>
	<li>5 分钟结束后，随机选取十个视野进行图像采集（方法如步骤 3.1 所述），但在采集前需停止流动。</li>
	<li>按照步骤 3.2 所述方法分析所采集的图像，并量化每个视野中残留细菌的平均数量。</li>
</ol>
5. 测量单个贴壁细菌生长至微菌落的过程
<ol>
	<li>使用注射泵将含有10% (v/v) FBS、并在加热平台上维持于37°C的Endo-SFM引入腔室，施加选定的剪切应力持续数小时。每5分钟采集一帧图像，用于实时视频显微观察。</li>
	<li>完成视频显微观察后，关闭注射泵以停止施加剪切应力，再采集2-3张附加图像，随后在软件中停止图像采集程序。视频2展示了细菌增殖的一个示例。</li>
</ol>
6. 测定粘附性细菌微菌落的流动阻力
<ol>
	<li>在细胞表面形成较大的微菌落（步骤5.2）后，在施加流动之前，先通过相差显微镜获取细胞图像，并通过GFP荧光获取细菌图像，各拍摄2-3张。在后续实验中，成像方案将仅监测荧光信号。</li>
	<li>施加高剪切应力5分钟（3-100 dynes/cm2），每5秒记录一帧图像。</li>
	<li>通过关闭注射泵停止剪切应力，再获取2-3张附加图像，然后在软件中停止图像采集序列。</li>
	<li>接下来，首先小心移除“出口”管路，避免通道排空，然后加入预热的新鲜培养基以填充小室，再移除“入口”管路。</li>
	<li>为了定量确定剪切应力对细菌抗性的影响，可进行平板培养实验：收集剩余培养基，并用120 μl PBS洗涤μ-Slide两次，以清除通道中残留的培养基（两次洗涤液也需一并收集）。</li>
	<li>加入50 μl胰蛋白酶/EDTA，在37°C孵育5分钟以解离感染的细胞，并将解离后的细胞样品与上一步收集的悬浮液混合。</li>
	<li>在PBS中进行系列稀释，取10 μl稀释液，每种稀释度设三个重复，接种于GCB琼脂平板上，37°C、5% (v/v) CO2培养箱中孵育，次日计数菌落形成单位（CFU）。</li>
</ol>
视频3和视频4比较了野生型菌株与pilV突变株。
7. 微菌落中细菌的脱离
<ol>
	<li>通过重复步骤 2.1 至 2.8，在流室中感染细胞，并使感染持续 30 分钟。</li>
	<li>将流速提高至 10 dynes/cm2，持续 2 分钟，以去除未结合的细菌，随后继续感染 2 小时。</li>
	<li>将流速降低至 0.15 dynes/cm2。</li>
	<li>每小时收集一滴从流室中流出的培养基。</li>
	<li>对样品进行连续稀释，并接种至 GCB 琼脂平板上。</li>
	<li>将平板置于含 5% (v/v) CO2 的培养箱中，37°C 培养过夜后，于次日测定菌落形成单位（CFU）数量。</li>
</ol>
8. 典型结果
<img alt="细菌生物膜形成过程；示意图显示黏附、增殖、脱落阶段。" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 1"> 
图1： 在流动条件下可观察和测量的细胞单层不同阶段。
<img alt="光镜下的细胞结构；细胞细节，显微图像，生物学研究。" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2： 实验开始时流动腔室中的内皮细胞单层（无剪切应力）。约 50 个内皮细胞排列成亚融合单层。
<img alt="细菌随时间增长的曲线图；时间与细菌数量；实验数据分析。" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3： 细菌在细胞表面初始黏附的图示。显示了三个视野的数据，用以反映预期的视野间变异（0,044 dynes/cm2）。
视频 1. 细菌在细胞单层上初始黏附随时间变化的可视化（0.044 dynes/cm2）。表达GFP的细菌随流动培养基方向移动。视频加速60倍，实际时长为10分钟。 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3241/3241video1.mov">点击此处观看视频。</a>
视频 2. 细菌在细胞表面初始黏附后，允许其增殖 7 小时（加速 1000 倍）。 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3241/3241video2.mov">点击此处观看视频。</a>
视频 3. 在细胞表面增殖后，通过将剪切应力水平提高至 10 dynes/cm2 持续 5 分钟，测试微菌落的机械抗性，但野生型微菌落可耐受高达 60 倍的加速剪切应力。 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3241/3241video3.mov">点击此处观看视频。</a>
视频 4. pilV 突变株形成的微菌落会因流速增加（10 dynes/cm2）而被破坏。该突变株无法诱导微菌落下细胞质膜的重塑，因此对剪切应力的增加更为敏感（视频加速 60 倍）5。 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3241/3241video4.mov">点击此处观看视频。</a>

<ol><li>Mairey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+microcirculation+shear+stress+levels+determine+Neisseria+meningitidis+attachment+sites+along+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier.</a> J Exp Med. 203, 1939-1950 (2006).</li>
<li>Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+Principles+of+Vascular+Beds%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Design Principles of Vascular Beds.</a> Circ Res. 77, 1017-1023 (1995).</li>
<li>Zarbock, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+adhesion+and+activation+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Neutrophil adhesion and activation under flow.</a> Microcirculation. 16, 31-42 (2009).</li>
<li>Tissot, O., Pierres, A., Foa, C., Delaage, M., Bongrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motion+of+cells+sedimenting+on+a+solid+surface+in+a+laminar+shear+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Motion of cells sedimenting on a solid surface in a laminar shear flow.</a> Biophys J. 61, 204-215 (1992).</li>
<li>Mikaty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+bacterial+pathogen+induces+host+cell+surface+reorganization+to+resist+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Extracellular bacterial pathogen induces host cell surface reorganization to resist shear stress.</a> PLoS Pathog. 5, e1000314-e1000314 (2009).</li>
<li>Chamot-Rooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+modification+of+pili+upon+cell+contact+triggers+N.+meningitidis+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Posttranslational modification of pili upon cell contact triggers N. meningitidis dissemination.</a> Science. 331, 778-782 (2011).</li>
<li>Soyer, M., Dumínil, G. Bacterial adhesion under shear stress. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSoyer%2C+M+%22Neisseria+meningitidis%3A+Methods+and+Protocols+%28Methods+in+Molecular+Biology%29%22">Neisseria meningitidis: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology)</a>. Christodoulides, M. , Humana Press Inc. New York. (2011).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+International%22%5BJournal%5D)">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li>
<li>Thomas, W. E., Trintchina, E., Forero, M., Vogel, V., Sokurenko, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+adhesion+to+target+cells+enhanced+by+shear+force%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force.</a> Cell. 109, 913-923 (2002).</li>
<li>Tchesnokova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear-enhanced+binding+of+intestinal+colonization+factor+antigen+I+of+enterotoxigenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Shear-enhanced binding of intestinal colonization factor antigen I of enterotoxigenic Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 76, 489-502 (2010).</li>
<li>Konto-Ghiorghi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+role+for+pilus+in+adherence+to+epithelial+cells+and+biofilm+formation+in+Streptococcus+agalactiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Dual role for pilus in adherence to epithelial cells and biofilm formation in Streptococcus agalactiae.</a> PLoS Pathog. 5, e1000422-e1000422 (2009).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

剪切应力以及力学因素在生物学中的重要性正日益受到重视。例如，在引入剪切应力的条件下，已发现选择素（Selectin）蛋白家族在淋巴细胞黏附并沿血管壁滚动过程中的高度适应性黏附特性。上述方法已应用于革兰氏阴性菌 Neisseria meningitidis，但也应适用于多种其他病原体。剪切应力的重要性在其他病原体及感染部位的研究中也已得到证实。由尿路致病性大肠杆菌（Escherichia coli, UPEC）表面的FimH黏附素介导的细菌黏附过程即是在剪切应力条件下被揭示的9。与选择素类似，FimH与其宿主细胞受体之间的相互作用被剪切力诱导的机械力所增强9，而肠毒素型大肠杆菌（E.coli）的CfaE黏附素也被报道通过依赖剪切力的机制介导其与肠上皮细胞的黏附10。我们曾利用本章节所述的层流 chamber 实验方案报道，无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）的菌毛在该病原体于流动条件下黏附上皮细胞的过程中起着关键作用11。此类研究证实，我们的流动 chamber 实验是一种研究剪切应力条件下宿主细胞与病原体相互作用的有效工具。

<table><tbody><tr><td>&amp;mu;-Slide VI&lt;sup&gt;0.4&lt;/sup&gt; 流体实验套件</td><td>IBIDI</td><td>80606</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 鲁尔锁注射器 Plastipak</td><td>BD Biosciences</td><td>300865</td><td></td></tr><tr><td>Tygon R3603 软管 3.2 × 4.8 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>R3603</td><td></td></tr><tr><td>三通旋塞阀，两母鲁尔接头转一公鲁尔接头</td><td>Bio-Rad</td><td>7328103</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PHD 2000</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜，Nikon</td><td>Nikon Instruments</td><td>Eclipse T&lt;em&gt;i&lt;/em&gt;</td><td></td></tr><tr><td>CCD 相机</td><td>Hamamatsu Corp.</td><td>ORCA 285 CCD 或 ORCA 3-CCD</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>免费软件 (&lt;a href=&quot;http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/&lt;/a&gt;)</td><td></td></tr></tbody></table>

在细菌黏附研究中引入剪切应力

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

在细菌感染过程中，病原体与其宿主之间会发生一系列相互作用。细菌对宿主细胞表面的黏附通常是致病过程的初始且决定性步骤。尽管实验上黏附作用大多在静态条件下进行研究，但实际上黏附发生在液体流动的环境中。细菌与其宿主的初次接触通常发生在黏膜层面，如口腔、肺部、肠道、眼睛等部位，这些区域的黏液沿着上皮细胞表面流动。在感染后期，病原体有时会进入血液循环，引发危及生命的疾病，例如败血症、脓毒症和脑膜炎。这些感染的一个显著特征是病原体能够在血液流动的条件下与内皮细胞相互作用。流动液体（如黏液或血液）的存在决定了黏附过程，因为它会对病原体施加机械力。为了表征流动液体的影响，通常会参考剪切应力（shear stress）这一概念，即流体在静止壁面附近单位面积上施加的切向力，单位为达因/平方厘米（dynes/cm2）。剪切应力的强度因血管类型、大小、器官和位置等因素而异（0–100 dynes/cm2）。毛细血管中的血流可达到极低的剪切应力值，甚至在数秒至数分钟的时间段内暂时停止1。而在另一端，微动脉中的剪切应力可高达100 dynes/cm22。剪切应力对多种生物过程的影响已有明确报道，例如白细胞与内皮细胞之间的相互作用3。为了在细菌黏附过程中考虑这一力学参数，我们采用了一种基于一次性流动腔室的实验方法4。将宿主细胞培养于流动腔室内，通过注射泵控制流速，引入荧光标记的细菌。我们最初的研究聚焦于细菌病原体Neisseria meningitidis，这是一种革兰氏阴性菌，可导致败血症和脑膜炎。此处描述的方法使我们能够研究剪切应力对细菌能力的影响，包括：黏附于细胞1、在细胞表面增殖5以及脱离并定植新位点6（图1）。更多技术细节可参见参考文献7。本文所采用的剪切应力值基于我们以往的经验1，并参考了文献中报道的典型数值。本方案适用于多种病原体的研究，具体操作可根据研究目标进行相应调整。

在感染过程中，一个关键步骤是病原体与宿主细胞之间的黏附。大多数情况下，这种黏附过程发生在流动液体所产生的机械应力环境中。本文介绍一种将剪切应力作为重要参数用于研究细菌黏附的技术。

在细菌感染过程中，病原体与其宿主之间会发生一系列相互作用。细菌对宿主细胞表面的黏附通常是……

本视频演示了一种研究剪切应力对细菌黏附影响的实验方法。在由如尼斯氏菌（Nice sirium mens）等细菌病原体引起的严重感染过程中，病原体进入血液后，在流动血液产生的机械应力作用下，会附着并定植于宿主细胞。在增殖后，部分细菌会脱离原位并定植到新的部位，从而重新启动这一循环。为了研究影响细菌对宿主细胞黏附能力的各种因素，将内皮细胞接种于一次性流动腔室中进行培养，直至细胞达到汇合状态。加入荧光标记的细菌，并通过实验控制剪切应力。使用注射泵，通过显微镜观察细菌对宿主细胞的黏附及其增殖情况。对获得的视频进行分析，以确定剪切应力对内皮定植过程的影响。该方法对于研究小鼠脑膜炎的发病机制非常有用，也可用于研究在发病过程中经历剪切应力的其他细菌。该技术在操作上可能有一定难度，尤其是在向系统中引入气泡时，这可能会带来问题。今天将由我实验室的博士研究生Mega演示该操作过程。本视频中描述的实验使用在IDI微孔载玻片六孔0.4中培养的细胞进行，该载玻片由一次性无菌塑料制成，包含六个长17毫米、宽3.8毫米、深0.4毫米的通道。每个通道两端各有一个带鲁尔接头的进样口，用于引入细胞。向每个通道中加入30微升浓度为1×10⁶的细胞悬液。将载玻片置于37°C、含5% CO₂的湿润培养箱中，使细胞贴壁培养3小时。孵育结束后，再加入 120 微升的内皮 SFM。细胞在约 20 小时后应形成亚融合的单层，以填满孔板。在此期间，将表达 GFP 的无乳链球菌（Nice sirium meningitis）划线接种至 APL 平板上，该细菌是一种人类病原体。因此，对这种微生物的任何操作都应在二级生物安全实验室中进行，并由经过培训的人员穿戴防护服和手套操作；建议对操作人员接种所使用血清型的疫苗。这是表达GFP的8 0 1 3菌株，在IPTG诱导型启动子控制下进行培养。在37摄氏度、5% CO2培养箱中，将细菌接种于含Kellogg补充剂及每毫升5微克氯霉素的GC BPL培养基上，培养16小时。待哺乳动物细胞培养建立后，将细菌加入通道中的宿主细胞。为进行流式分析实验，使用接种环从培养皿中收集细菌，转移至含有预热的、添加补充剂的内皮细胞培养液的50毫升锥形管中。使用中等强度内皮细胞无血清培养基（Medium Endo SFM）。用相同培养基稀释样品，调整光密度至 OD 600 为 0.05，最终体积为五毫升。为诱导 GFP 表达，加入 IPTG 至终浓度为 1 毫摩尔/升，并将培养物孵育 120 分钟。在加湿、37摄氏度、5% CO2的摇床培养箱中。将先前培养好的内皮细胞微载玻片置于倒置显微镜的载物台上，显微镜需配备加热平台以维持样品温度为37摄氏度。将预热的含2% FBS的内皮细胞无血清培养基（endo SFM）倒入无菌玻璃容器中，并通过拉动活塞将培养基吸入50毫升注射器内。将进样管路连接至三通旋塞阀。接着，将进样管路连接到注射器，并推动推杆，使管路充满培养基。使用提供的直角连接器，小心地将进样管路的另一端连接至微滑片。避免将空气引入腔室。将注射器放置在泵上，然后将一个剪去底部的一毫升注射器安装在三通阀的可用插槽上作为储液槽。接着将出口管连接到通道的另一端，并通过推动注射器活塞，小心地向通道内注入培养基，直至距离腔室出口约一厘米处。测量细菌的 OD 600，并用含 2% FBS 的 SFM 调整至 0.15，像之前一样剧烈涡旋样品以打散细菌聚集体。接着，使用一次性塑料移液管将 100 微升添加了 2% FBS 的 SFM 培养基转移至储液槽中。然后从涡旋后溶液的上层吸取 100 微升细菌溶液，并加入储液槽中。小心转动旋塞，将细菌注入微载玻片腔室，使其在受控的剪切应力水平下进行黏附。使用注射泵以每小时3.5毫升的速度向腔室内引入含2% FBS的内皮细胞无血清培养基（endo SFM），持续15分钟。本视频已加速60倍。实际持续时间为10分钟。在此步骤之后，可在不同条件下评估细菌与宿主细胞的黏附与脱离，具体方法将在视频后续章节中加以描述。为了定量分析单个细菌对宿主细胞的初始黏附，应在流动开始后15分钟、液体仍在循环时开始采集图像，采集10个随机视野的图像，以确定每视野黏附细菌的平均数量。首先打开图像分析软件，并打开待分析的图像。点击图像菜单，然后选择调整亮度与对比度。通过移动光标调节强度水平，优化单个黏附性荧光细菌相对于背景的可视化效果。然后在插件中打开细胞计数器菜单，启动细胞计数器工具，初始化图像，选择目标类型，并逐一点击每个细菌个体。窗口中显示细菌的总数。最后，将每张图像的数据导出至 Excel，取平均值以量化每个视野中黏附细菌的平均数量，从而测量单个黏附细菌对流动的抗性。在初始的 15 分钟流动程序之后，设置注射泵以产生 3 至 100 达因/平方厘米的剪切应力，持续 5 分钟。五分钟后，停止流动，随机采集并分析10个视野，方法同前，以确定每个视野中残留细菌的平均数量。在初始15分钟的流动结束后，将注射泵调节至选定的剪切应力。继续流动数小时，每五分钟记录一次图像，每次采集一帧。理想情况下，如果显微镜配备了电动控制的XY平台，可以同时追踪多个位置。视频显微观察结束后，通过关闭注射泵来终止剪切应力。立即再采集两到三幅图像，然后在软件中停止图像采集序列。此处可见细菌增殖的一个示例。最后，为分析图像，使用 ImageJ 的“图像调整阈值”菜单将图像转换为二值图像。然后在“分析”菜单下的“设置测量”中，选择面积测量。然后使用分析颗粒工具自动测定菌落的大小。无论此时是否维持流动，5至7小时后细胞表面均会形成较大的微菌落。为测量微菌落对流动的抗性，首先通过相差显微镜获取细胞的2至3张图像，同时通过GFP荧光获取细菌的2至3张图像。施加高剪切应力持续五分钟，并每五秒采集一帧荧光图像。通过关闭注射泵来停止剪切应力。再获取两到三张额外图像，然后在软件中停止图像采集序列，以便收集培养基进行铺板实验。首先，取下出口管路，注意避免排空通道。加入预热的新鲜培养基以充满各孔。然后取下入口管路，用微量移液器收集剩余的培养基，并转移至微量离心管中。为清除通道中残留的培养基，向通道中加入 120 µL PBS，冲洗微载玻片两次。将载玻片倾斜两次并弃去培养基。为收集感染的细胞，向微型载玻片中加入 50 微升胰蛋白酶 EDTA 溶液，在 37 摄氏度孵育 5 分钟以使细胞从通道上脱落，并将此脱落的样本与前一步骤中收集的悬液混合。随后在 PBS 平板中进行连续稀释，取 10 微升等分试样接种于 GCB 琼脂平板，三复孔置于 37 摄氏度、5% CO2 条件下过夜培养。第二天测定菌落形成单位数量，以评估细菌从微菌落上的脱离情况。按照之前的方法，在低流速（3.5 毫升/小时）条件下感染流室中的细胞；30 分钟后，将流速提高至 5 毫升/分钟，持续 2 分钟，以去除未结合的细菌，随后恢复低流速（3.5 毫升/小时），继续感染 2 小时。之后每小时收集一滴从流室流出的培养基至微量离心管中，持续收集 4 小时。所有样品收集完毕后，按先前方法测定菌落形成单位数。该图表示细菌在细胞表面的初始黏附情况。图中每条线代表在特定视野中，随时间变化而累积结合的细菌数量。三个区域的数值用于反映细胞表面增殖后预期的区域间变异情况。通过将剪切应力提高至10达因/平方厘米来测试微菌落的机械抗性，结果显示，野生型微菌落具有抗性，而由pilV突变体形成的微菌落在流体剪切力增加时发生解体。该突变体无法诱导微菌落下方质膜的重塑，因此在其发育后对剪切应力的增加更为敏感。该技术为传染病领域的其他研究人员探索剪切应力对各种病原体与不同类型细胞相互作用的影响铺平了道路。请注意，操作人类病原体可能具有极高危险性，因此在执行本实验步骤时，必须始终采取相应防护措施，例如二级或三级生物安全防护措施。

introducing-shear-stress-in-the-study-of-bacterial-adhesion

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

在细菌粘附的研究剪应力

来源：Ditkowski, B.，等。一种用于研究细菌对移植物组织黏附的体外平行板灌注系统模型。J. Vis. Exp.

体外平行板流动模型用于研究细菌在组织活检样本上的黏附

来源：Claes, J., et al，在流动条件下研究细菌对血管壁黏附的体外与体内模型。J. Vis. Exp.

一种用于研究剪切力依赖性细菌黏附的体内模型

为了研究细菌在剪切应力条件下与血管的相互作用，需使用流动腔室和一种 体内 描述了肠系膜活体显微镜模型，可用于解析细菌和宿主因素在血管黏附中的作用。...

体外 与 体内 模型用于研究流动条件下细菌对血管壁的黏附

细菌附着于宿主细胞是宿主定植和感染过程中的关键步骤。本方案描述了制备聚合物偶联的重组黏附素作为仿生材料的方法，该材料可独立于其他细菌因子，用于分析单个黏附素在这些过程中所起的作用。...

用于表征细菌-宿主相互作用的仿生材料

该流动黏附实验为T细胞与上皮细胞相互作用提供了一个简单且高影响力的模型。通过注射泵产生剪切应力，并利用共聚焦显微镜采集图像以进行定量分析。这些研究的目标是在流动条件下有效量化T细胞的黏附情况。...

剪切应力下T淋巴细胞-黏附分子相互作用研究的黏附力检测方法

细胞表面黏附在机械转导过程中起核心作用，因其可传递机械张力并启动参与组织稳态与发育的信号通路。本文介绍一种利用配体包被的磁性微珠对黏附受体施加外力，以解析张力响应所激活的生化通路的实验方案。...

利用磁珠分析细胞表面黏附在机械张力作用下的重塑过程

我们开发了一种基于多孔板格式的聚丙烯酰胺检测方法，用于研究细胞外基质刚度对黏附细胞细菌感染的影响。该检测方法可与流式细胞术、免疫染色以及牵引力显微镜兼容，能够对细胞、其细胞外基质与致病菌之间的生物力学相互作用进行定量测量。...

一种基于多孔板格式聚丙烯酰胺的检测方法，用于研究细胞外基质刚度对黏附细胞细菌感染的影响

本文描述了一种高通量微流控生物反应器与荧光显微镜联用的方法，用于分析剪切应力对表达绿色荧光蛋白的铜绿假单胞菌（Pseudomonas...

剪切应力对活细胞分析的影响 铜绿假单胞菌 使用自动化高通量微流控系统

该方法可用于定量分析贴壁依赖性细胞在纤连蛋白上的早期黏附和铺展动态。此外，该实验还可用于研究氧化还原稳态改变对细胞铺展和/或细胞黏附相关胞内信号通路的影响。...

在氧化应激条件下研究上皮细胞在纤连蛋白上的细胞黏附与铺展动态过程

本方案介绍了进行黏附足迹实验以成像快速细胞滚动黏附过程中黏附事件的实验步骤。...

成像细胞滚动过程中分子黏附的黏附足迹检测法

了解利用流动腔模拟血流剪切应力研究细菌对内皮细胞粘附的实验方法。该技术可定量分析Neisseria meningitidis等病原体的初始粘附率及定植动态，为感染病理机制研究提供可靠框架。

在细菌黏附研究中引入剪切应力

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