通过显微注射实现嗜尸线虫Pristionchus pacificus的RNAi介导基因敲低与转基因

本实验的总体目标是成功将外源 DNA 转入普里扬卡太平洋线虫（Priyanka Pacificus nematodes）中，并实现基因功能的敲低。进行转基因操作时，首先准备具有相容性黏性末端的适当基因组 DNA。

进行RNA干扰时，使用双链RNA转录试剂盒合成目的基因。随后将DNA或双链RNA显微注射到PRIs DIANCA pacificus的卵中。在转基因实验中，筛选F1代个体中具有所选标记表型的个体；在RNA干扰实验中，则筛选具有基因敲低表型的个体。

继续监测两个转基因线虫的F代结果，通过荧光显微镜观察GFP报告基因的表达情况，以获得显示特定基因表达的结果。大家好，我是来自加州州立大学北岭分校的Ray Hong，本演示将概述在特定矛线虫中进行遗传操作的步骤。对于新兴的模式生物而言，开展RNA干扰（RNAi）和转基因技术能够通过鉴定基因功能与表达模式，回答发育生物学和行为学中的关键科学问题。

初次使用该方法的研究人员可通过观看操作视频，学习如何将线虫放置在注射垫上，并在正确的焦平面上进行注射，以确保可见生殖腺。与甘油三酯不同，SCA特异性生殖腺在背部相互交叉，并随着线虫从晚期J4阶段发育为成虫而发生迁移。此外，应将使用相容性限制性内切酶消化的基因组DNA加入到您的转基因片段和共注射标记物中，以制备注射混合物。

我实验室中的 Jessica Single 将演示 PRIs 模式下用于转基因的显微注射技术。进行注射时需要 3D NA 载体，其中包含共注射标记、目标报告转基因以及基因组 D-N-A-D-N-A 载体。这些 DNA 载体需使用相容的限制性内切酶进行消化处理，随后通过乙醇沉淀法回收 DNA 载体。

将注射混合物配制为表中所列的浓度。检查氮气罐压力表的设置。现在将一到两微升的注射混合物吸入针头中。

将针头放入显微注射操作仪中。通过将针尖轻轻接触置于载玻片上的细拉毛细管边缘来折断针尖，并将针头置于空闲位置。现在加入石蜡油，覆盖含有四条年轻成虫线虫的 J 型培养板。

挑选一条线虫并将其转移至注射垫上。在显微镜下，将线虫的生殖腺朝向注射针方向摆放，使阴门远离注射针。随后将注射针缓缓下降至显微镜视野中的合适位置。

将上部性腺与针头调整至同一焦平面。轻柔地戳刺线虫，并注入混合液。观察到卵向远端尖端分离，表明注射成功。

重新定位针头以注射下方性腺，并重复注射操作。由于该性腺位于肠道下方，无法观察到卵的扩散情况，因此更难判断注射是否成功。然而，注射后线虫应保持完整，无外突的刺激物。

将针头放回闲置位置。用接种环取一些OP 50细菌，加入一滴M九缓冲液以转移线虫。用OP 50接触线虫，使其粘附。

现在将线虫转移至含有50微升OP50菌液斑的培养皿上。将注射后的线虫在20摄氏度条件下培养约四天，使其产卵并发育至F1代。随后对线虫进行目标表型的筛选。

挑选表现出目标表型的单个 F1 代个体，转移至新的铺有培养基的培养板，并在 25 摄氏度下保存。最后，对于转基因品系，将单个 F2 代个体分别转移至独立的培养板中。后续世代在 20 摄氏度下保存。

通过RNAi和转基因技术在个体水平上操控基因功能，是与左侧野生型蠕虫相比，Ppac pacificus作为进化发育生物学模型的关键方面。稳定的F4 PPR L3转基因品系产生一种显性滚筒表型，并显示出头部神经元的GFP表达。相反，该RNAi实验生成了PRL-1突变体，其完全丧失了在PRL-1滚筒功能获得性突变体TU92中通常观察到的滚动运动能力。一旦掌握技术，每次显微注射可在五分钟内完成。需要特别注意的是，必须将来自独立F1代转基因滚筒品系的所有F2代个体单独挑取，以建立独立的F2代转基因品系。

这是因为我们发现不同 F2 品系间的 GFP 表达水平存在高度变异性，且 Roller 表型的遗传与 GFP 表达水平并不相关。