定植于小鼠胃肠道的Pseudomonas aeruginosa的RNA提取

本实验的总体目标是从鼠源性 ECM 中回收的产气克雷伯菌中分离总 RNA。首先收集管腔内容物，然后分离细菌 RNA。

然后进行D'S处理和RNA纯化。最后，通过生物分析仪和分光光度分析对RNA进行定量，并检测其纯度。最终可获得足够质量和数量的细菌RNA，用于后续实验分析，如定量PCR（QPCR）、转录谱分析或RNA测序实验。

与现有的三醇提取等方法相比，该技术的主要优势在于其结合了多个裂解步骤，并采用极为严格的酸性条件和氯仿抽提步骤，以确保获得高质量的RNA。对该方法进行可视化演示至关重要，因为裂解和抽提步骤难以掌握，而书面方案往往省略了对成功至关重要的细微操作细节。本实验操作将由我实验室的博士后研究员Eduardo Lopez Medina和实验室主管Megan Neubauer进行演示。在开始收获样品前，IMSA会在液氮浴中清洗不锈钢研钵。

然后，在处死一只定植了产气假单胞菌的6至8周龄C3 HHEN小鼠后，将动物仰卧置于泡沫板上，并用95%乙醇冲洗腹部。接着，从胸骨至会阴部沿中线纵向切开皮肤。然后拉开皮肤和腹膜，暴露腹腔。

现在使用镊子切除整个盲肠。将盲肠悬置于不锈钢研钵上方，然后用解剖剪剪断盲肠的两端。用P1000移液器吸头吸取1 mL的Sequel Flush 8缓冲液，随后将吸头插入盲肠的近端。

将测序冲洗液八号缓冲液和测序管腔内容物冲入不锈钢研钵中。现在研磨测序样品。用无菌研杵冲洗八号内容物。

然后将乙醇倒入盛有干冰的容器中，并将一个50毫升聚丙烯圆锥形管放入干冰-乙醇浴中。将研磨后的冷冻结肠内容物转移至该圆锥形管中，并将管子置于-80摄氏度保存。接下来的这一系列步骤是整个实验过程中最难的部分。

鉴于从MI盲肠中提取的材料性质复杂，必须进行多次冷丝状提取，才能获得可接受的均一性和完整性，通常需要进行三到五次提取，直至水相与有机相之间的宽界面完全消失。将一份体积的酸性酚-氯仿转移至一个50毫升的橡树岭离心管中。用封口膜密封管盖，然后将离心管置于65°C水浴中温育。

取一半体积的裂解缓冲液加入50毫升聚丙烯圆锥管中，然后将缓冲液煮沸五分钟。从-80摄氏度冰箱中取出结肠腔内容物后，用手快速搓拭管壁使其短暂升温，随后将煮沸的裂解缓冲液加入该管中。振荡混合物，以充分混匀裂解缓冲液与结肠腔内容物溶液。

将裂解缓冲液和SQL管腔内容物煮沸五分钟。期间定期涡旋混合，打开含有苯酚-氯仿溶液的橡树岭离心管，将SQL内容物的裂解样品转移至该管中。然后用封口膜重新密封管盖，并将离心管放回65°C水浴中孵育10分钟，每隔两分钟轻轻摇动一次。

在4°C条件下，以2,500 × g离心15分钟洗涤样品。随后小心地将水相转移至一个新的50毫升Oak Ridge离心管中，避免接触任何白色界面。然后向新管中加入等体积的酸性酚-氯仿。

用封口膜密封管盖，并通过高速涡旋振荡充分混匀管内物质。继续离心样品，并将水相转移至离心管中。若上层水相体积过小，可将其转移至直径较小的离心管中。

继续此操作，直至水相与有机相之间无可见的白色界面。当白色界面消失后，小心地将水相转移至新的离心管中。然后向管中加入等体积的氯仿-异戊醇，盖紧管盖，并通过涡旋充分混匀内容物。

接下来，再次离心样品后，将水相转移至一个15毫升聚丙烯圆锥形离心管中，并加入等体积的异丙醇。然后在-20摄氏度下孵育溶液至少2小时或过夜。孵育完成后，将离心管以45分钟离心。

在确认管底出现凝胶状沉淀后，移除上清液。随后，加入1毫升冰浴预冷的70%乙醇，通过涡旋振荡管体清洗沉淀，然后在4°C条件下以10,000 × g离心5分钟。最后，移除上清液并将管子倒置，使沉淀在室温下静置干燥10分钟。

然后将RNA沉淀重悬于200微升无RNA酶的水中。首先，向微量离心管中加入20微升10× Turbo DNase缓冲液和2微升Turbo DNase，轻轻混匀溶液。随后将管子在37摄氏度孵育20分钟，然后向管中加入20微升重悬的DNA灭活试剂，充分混匀。

室温下轻轻混匀，继续孵育5分钟。接着，在微型离心机中以10,000 × g离心1.5分钟，使沉淀聚集，然后将上清液转移至新的微量离心管中。向沉淀中加入等体积的冷酸性酚-氯仿溶液，再通过涡旋振荡1分钟，充分混匀。

在12,500 ×g条件下离心溶液2分钟后，将水相转移至新管中，并加入等体积的氯仿-异戊醇。然后在相同条件下再次离心溶液，之后通过涡旋振荡混合溶液。将水相转移至新的微量离心管中。

然后加入0.1倍体积的3摩尔醋酸钠和2.5倍体积的冰冻100%乙醇。涡旋混匀管内溶液。将样品在-80摄氏度孵育30分钟。

然后在4 °C条件下，以12,000 × g离心30分钟，弃去上清液。最后用1 mL冰冷的70%乙醇洗涤沉淀。弃去上清液，并将沉淀在空气中干燥10分钟。

然后将沉淀重悬于100微升无RNA酶的水中。Agilent Bioanalyzer是一种基于微流控技术的平台，用于DNA、RNA、蛋白质和细胞的片段大小分析、定量及质量控制，其利用一种称为RNA完整性指数（RNA integrity number，RIN）的指标来评估RNA质量。采用本方案提取的RNA，其260/280比值范围为1.7至2.0，RIN值大于或等于7.0。

左侧显示的是细菌RNA的安捷伦生物分析仪电泳图谱示例，右侧显示的是从小鼠小肠液内容物中回收的假单胞菌（Pseudomonas arosa）的凝胶样图像。通过本实验流程后，可进一步采用其他方法，如定量PCR或RNA测序，以回答更深入的问题，例如精细的基因表达谱分析。