Name: 追踪中性粒细胞腔内的爬行，活体视频显微镜Transendothelial组织中的迁移和趋化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 1 s
Description: 学习使用明场活体显微镜和延时摄影技术，在小鼠提睾肌组织中实时追踪中性粒细胞的管腔内爬行、跨内皮迁移和趋化运动。该方法为研究炎症反应中的白细胞募集机制提供了重要的可视化工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究得到了加拿大卫生研究院（CIHR, MOP-86749）研究基金的资助。L. Liu 是加拿大卫生研究院新研究者奖（MSH-95374）的获得者。

1. 制备琼脂糖凝胶中的趋化因子
<ol>
<li>用移液器将10 mL的2×PBS加入50 mL锥形管中，并将该管放入盛有热水的烧杯中预热。</li>
<li>用移液器取10 mL蒸馏水，加入另一只50 mL锥形管（管盖稍松）中，再加入0.4 g琼脂糖粉末，放入微波炉加热至刚刚沸腾（在700瓦微波炉中约加热1分钟）。</li>
<li>将预热的2×PBS加入琼脂糖溶液管中，轻轻涡旋混匀，并将混合液置于热水烧杯中保温。</li>
<li>用微量移液器将趋化因子溶液（例如：10 µL含0.5 µg的CXC趋化因子MIP-2，或12 µL含1 mM的WKYMVm）加入含有3 µL印度墨水的1.5 mL Eppendorf管盖中，用微量移液器反复吸打充分混匀（避免产生气泡）。</li>
<li>剪去200 µL移液枪头的尖端，用微量移液器将110 µL 42°C的琼脂糖溶液加入管盖中，立即用另一枪头充分混匀（避免产生气泡）。</li>
<li>将含有趋化因子的凝胶置于+4°C保存。</li>
</ol>
2. 活体显微镜观察用提睾肌的制备（图1）
<ol>
<li>通过腹腔注射 10 mg/kg 赛拉嗪和 200 mg/kg 盐酸氯胺酮混合物，对成年雄性小鼠进行麻醉。</li>
<li>使用电动剃须刀剃除右侧颈外静脉区域及阴囊前部的毛发。麻醉后，需特别注意并妥善护理麻醉状态下的小鼠。可使用加热灯防止小鼠体温过低。小鼠应无疼痛反射。</li>
<li>作一横向切口，使用充满含 100 U/mL 肝素生理盐水的 PE-10 导管寻找并插管颈静脉。颈静脉插管可用于必要时追加麻醉剂和其他药物的给药。</li>
<li>用脐带绑带固定小鼠后肢，使小鼠仰卧于自制的提睾肌固定板上（图 1）。</li>
<li>将固定板连接至 37°C 水循环系统，以保持提睾肌及小鼠体温。</li>
</ol>

注意：所有从 2.6 到 2.14 的步骤都必须非常轻柔地进行5。

<ol start="6">
<li>在阴囊皮肤上做切口，暴露左侧提睾肌。仔细将肌肉与其相关的筋膜分离。</li>
<li>使用蠕动泵，以37°C预温的碳酸氢盐缓冲盐水（131.9 mM NaCl，4.7 mM KCl，1.2 mM MgSO4，20 mM NaHCO3，pH 7.4）灌流提睾肌。</li>
<li>用4−0缝线结扎提睾肌远端，将其固定在提睾肌观察板的透明观察玻璃基座上。</li>
<li>沿纵轴电灼提睾肌。使用4−0缝线将肌肉展平，并沿基座边缘固定。将睾丸和附睾从下方肌肉组织分离，并推入腹腔内。</li>
<li>以约0.6 ml/min的速度，用37°C预温的灌流缓冲液持续灌流肌肉，并用22×22 mm的玻璃盖玻片覆盖暴露的肌肉组织。</li>
<li>将提睾肌观察板置于显微镜载物台上，在显微镜下观察肌肉组织，选择一条合适的后微静脉（选择直且无分支、具有正常剪切率、管径在25−40 µm之间的静脉），并调整摄像机，使该静脉在电视监视器左侧或右侧垂直显示。</li>
<li>平衡30分钟后，使用录像机记录所选后微静脉5分钟的视频图像，作为基线对照数据。</li>
<li>停止灌流，并移除肌肉上的盖玻片。</li>
<li>在预先选定的区域，于提睾肌表面放置一块约1 mm3大小、含有趋化因子的凝胶，该区域应距离观察的后微静脉350 µm且与其平行。加盖盖玻片以固定凝胶，并以极慢速度（≤10 µl/min）灌流肌肉组织，以形成由凝胶缓慢释放的趋化因子浓度梯度。</li>
<li>加入含趋化因子凝胶后，连续记录90分钟的视频图像。在记录过程中，持续调整并保持显微镜焦点，观察静脉内及肌肉组织中黏附、爬行、跨内皮迁移和趋化运动的白细胞。</li>
<li>实验结束后，将视频文件导入计算机进行分析。</li>
</ol>

3. 使用 ImageJ 进行细胞追踪
<ol><li>在计算机上提取视频并将其转换为 AVI 格式（例如，使用免费计算机软件 bitRipper 将 DVD 视频转换为 AVI 文件）。</li>
<li>使用视频编辑软件生成延时视频。例如，使用 Windows Movie Maker 从原始实时视频中制作延时视频（以 30 帧/秒速率生成 1/512 或 1/1024 速度的延时视频）。将未压缩的延时视频转换并保存为 DV-AVI 格式。</li>
<li>在相同的显微镜设置下拍摄校准微尺的图像， 
将图像导入计算机，使用 ImageJ 打开图像。在 ImageJ 中，屏幕左上角会显示总像素数（例如，720×480 像素）。测量屏幕 X 和 Y 轴方向的尺寸（例如，200×150 µm）。由此计算每单位长度的像素数 µm （例如，x = 720/200 = 3.6 像素/µm，且 y = 480/150 = 3.2 像素/µm).
</li>
<li>再次打开 ImageJ，点击“文件−导入−使用 Quicktime 电影插件”，选择待分析的视频，然后在“QT 电影打开器”界面中点击“确定”。
</li>
<li>单击“Plugins−Manual Tracking”以追踪细胞。在开始追踪前，先在底部字段中填写相关信息。简而言之，
<ol>
<li>时间间隔（秒）= 倍数时间间隔 / 30（例如，1020× 时间间隔对应 1020 / 30 = 每帧间隔 34 秒）。
</li>
<li>x/y 校准 = 该 µm/pixe使用微米尺图像校准进行长度测量。
</li>
<li>z轴校准 = 0（由于小鼠提睾肌是一种极薄的组织层，在明场透射照明下，细胞爬行与迁移近似为二维运动）。
</li>
<li>中心定位搜索方块尺寸 = 1。
</li>
<li>点大小/线宽/字体大小：可根据需要进行调整。
</li>
</ol>
</li>
<li>选择一个稳定且清晰的点作为参考点。该参考点可以是实验全程中保持不变且清晰可见的任意微小结构点。点击“添加轨迹”以追踪该参考点从第一帧到最后一帧的运动，并点击“结束追踪”。数据将自动显示在结果表格中。

</li>
<li>逐一追踪爬行和迁移的中性粒细胞：点击“添加轨迹”以追踪细胞从在组织中出现到每一帧中消失的过程，然后点击“结束轨迹”以完成并保存结果至 Microsoft Excel。
</li>
</ol>

4. 中性粒细胞募集参数的分析

<ol>
<li>在 Microsoft Excel 中打开结果文件，并分析数据（将参考点的变化纳入分析）。
</li>
<li>管腔内爬行
<ol>
<li>爬行距离：细胞从初始黏附位点到最佳跨内皮迁移位点在管腔内爬行的总距离（µm）。
</li>
<li>爬行速度：爬行距离/时间（µm/min）。
</li>
</ol>
</li>
<li>跨内皮迁移
<ol>
<li>迁移时间：从细胞开始跨内皮迁移，到整个细胞体刚好移出微静脉且管腔内不可见细胞体为止的时间（min 或 sec）。
</li>
<li>脱离时间：从整个细胞体刚好移出微静脉（迁移刚完成）到细胞与微静脉失去接触（尾部回缩）的时间点（min 或 sec）。
</li>
</ol>
</li>
<li>组织中的趋化迁移
<ol>
<li>迁移距离：细胞在组织中从迁移起点到终点所移动距离的总和（µm）。
</li>
<li>迁移速度：组织中迁移距离/时间（µm/min）。
</li>
<li>趋化距离：细胞在组织中沿 x 轴方向迁移距离的总和（µm）。
</li>
<li>趋化速度：趋化距离/时间（µm/min）。
</li>
<li>趋化指数：趋化距离与组织中迁移距离的比值。
</li>
</ol>
</li>
</ol>
5. 代表性结果：
尽管明场活体显微镜技术可用于研究白细胞与内皮细胞的相互作用，且不一定专用于中性粒细胞，但我们通过组织学分析证实，在经中性粒细胞趋化因子处理的小鼠 cremaster 肌肉中，超过 95% 的募集细胞确为中性粒细胞。本报告中，我们使用中性粒细胞特异性趋化因子，介绍了追踪中性粒细胞募集过程的操作步骤 体内具体而言，我们描述了一种在麻醉小鼠的提睾肌组织中，利用延时活体视频显微镜和ImageJ软件追踪中性粒细胞管腔内爬行、跨内皮迁移及趋化运动的实验方案。将含有趋化因子的琼脂糖凝胶置于提睾肌表面，可缓慢释放趋化因子，从而在组织中建立趋化因子浓度梯度。中性粒细胞趋化因子可诱导小鼠提睾肌后微静脉中中性粒细胞与内皮细胞之间的相互作用。整个实验过程通过直立式明场活体显微镜观察，彩色摄像机将图像投射至电视监视器，并由录像机记录。我们检测了在含有中性粒细胞趋化因子MIP-2和WKYMVm的琼脂糖凝胶刺激下，中性粒细胞在管腔内的爬行、跨内皮迁移以及在肌肉组织中的迁移和趋化反应（图2）。我们发现，MIP-2（在
0.5 µM）以及 WKYMVm（0.1 mM）均能诱导中性粒细胞在管腔内以相似的速度爬行，中性粒细胞穿越内皮迁移并从微静脉脱离的时间相近，在肌肉组织中的迁移速度几乎相同，且中性粒细胞趋化指数也相似（P &gt; 0.05，学生 t 测试）。
<img src="/files/ftp_upload/3296/3296fig1.jpg" alt="用于肌肉分析的显微镜装置示意图，包含CCD相机、泵、水浴槽和光学测速仪。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 活体显微镜系统的示意图。小鼠提睾肌被置于显微镜载物台上的提睾肌板透明观察平台上，并用37°C预温的碳酸氢盐缓冲生理盐水进行表面灌流。直立式显微镜连接一台CCD彩色视频相机，用于明场活体显微成像。另有一台黑白深度制冷CCD数字相机连接至显微镜端口，用于荧光活体显微成像，其图像可由计算机直接处理。
<img src="/files/ftp_upload/3296/3296fig2.jpg" alt="比较MIP-2与WKYMVm对细胞迁移参数（速度、跨膜迁移）影响的柱状图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 明场活体显微镜下中性粒细胞募集参数。 
通过在紧邻毛细血管后微静脉350 µm处放置的琼脂糖凝胶中逐步释放中性粒细胞趋化因子MIP-2或WKYMVm，诱导中性粒细胞募集。实验的实时视频记录经处理后，使用ImageJ分析延时视频数据。在C57BL/6小鼠（n = 3）的骨骼肌上施用MIP-2或WKYMVm琼脂糖凝胶后，测定中性粒细胞管腔内爬行（A）、跨内皮迁移时间与脱离时间（B）、组织中的迁移速度与趋化速度（C），以及骨骼肌中的趋化指数（D）。追踪细胞数量分别为：MIP-2组22个（A和B）与27个（C和D），WKYMVm组26个（A和B）与44个（C和D）。

<ol><li>Liu, L., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+leukocyte+recruitment%3A+organ-specific+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of leukocyte recruitment: organ-specific mechanisms of action.</a> Thromb. Haemost. 89, 213-220 (2003).</li>
<li>Petri, B., Phillipson, M., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiology+of+leukocyte+recruitment%3A+an+in+vivo+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The physiology of leukocyte recruitment: an in vivo perspective.</a> J. Immunol. 180, 6439-6446 (2008).</li>
<li>Phillipson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraluminal+crawling+of+neutrophils+to+emigration+sites%3A+a+molecularly+distinct+process+from+adhesion+in+the+recruitment+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Intraluminal crawling of neutrophils to emigration sites: a molecularly distinct process from adhesion in the recruitment cascade.</a> J. Exp. Med. 203, 2569-2575 (2006).</li>
<li>Wong, C. H., Heit, B., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulators+of+leucocyte+chemotaxis+during+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular regulators of leucocyte chemotaxis during inflammation.</a> Cardiovasc. Res. 86, 183-191 (2010).</li>
<li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research%3A+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li>
<li>Bullen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+imaging+techniques+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Microscopic imaging techniques for drug discovery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).</li>
<li>Hazelwood, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entering+the+Portal%3A+Understanding+the+Digital+Image+Recorded+Through+a+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Imaging+Cellular+and+Molecular+Biological+Functions%22%5BJournal%5D)">Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope.</a> Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).</li>
<li>Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-selectin+facilitates+emigration+and+extravascular+locomotion+of+leukocytes+during+acute+inflammatory+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo.</a> J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).</li>
<li>Cara, D. C., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+as+a+tool+for+studying+recruitment+and+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis.</a> Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).</li>
<li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LSP1+is+an+endothelial+gatekeeper+of+leukocyte+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration.</a> J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).</li>
<li>Heit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K+accelerates%2C+but+is+not+required+for%2C+neutrophil+chemotaxis+to+fMLP%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP.</a> J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

活体显微镜是揭示炎症过程中白细胞募集的细胞和分子机制的关键工具。在提睾肌和肠系膜等透明组织的微血管中，对白细胞与内皮细胞相互作用进行定量可视化观察，仍是该技术应用的金标准1,5。传统的明场活体显微镜具有多种独特的技术优势，且在这些组织中发现的白细胞募集机制可适用于大多数体内组织in vivo1,2,6。然而，在肺、肝和脑等其他一些组织中，白细胞募集的机制已被发现与提睾肌和肠系膜中的机制显著不同1。此外，在透明度较低的组织中，必须使用荧光显微镜进行观察。
与基于荧光的显微技术相比，后者因对活细胞功能造成光损伤而广为人知，而明场活体显微技术在观察活体动物中细胞动态行为需要长时间成像时，更具生理相关性，对细胞和组织的伤害更小（因此产生的假象也更少）7。此外，该方法更便捷、成本更低，且无需荧光标记。另一方面，在活体显微技术中使用透射照明成像时，目前市场上可用的商业成像软件无法实现细胞运动的自动追踪。然而，可以在同一台明场活体显微镜上轻松搭建独立的荧光活体成像系统（例如，通过将图像投射至...

<table><tbody><tr><td>聚乙烯管，PE10</td><td>Becton Dickinson</td><td>427401</td><td>内径 0.28mm &amp;#215; 外径 0.61mm</td></tr><tr><td>印度墨水</td><td>Speedball Art</td><td>Super Black</td><td>100% 炭黑颜料，不含染料</td></tr><tr><td>电灼器</td><td>Aaron Medical</td><td>AA03</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Bayer HealthCare, Bayer Inc.</td><td>DIN 02169592</td><td></td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮</td><td>Bioniche Animal Health Canada, Inc.</td><td>DIN 01989529</td><td></td></tr><tr><td>小鼠重组 MIP-2</td><td>R&amp;D Systems</td><td>452-M2</td><td></td></tr><tr><td>WKYMVm</td><td>Phoenix Pharmaceuticals, Inc.</td><td>072-12</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td>超纯</td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sigma</td><td>H-3393</td><td></td></tr><tr><td>直立显微镜</td><td>Olympus</td><td>BX61WI</td><td></td></tr><tr><td>三芯片彩色视频摄像机</td><td>SONY</td><td>DXC-990</td><td></td></tr><tr><td>高清 DVD 视频录像机</td><td>LG Electronics Inc.</td><td>RH398H-M</td><td></td></tr><tr><td>电视监视器</td><td>LG Electronics Inc.</td><td>22LG30</td><td></td></tr><tr><td>水循环器</td><td>Thermo Scientific</td><td>HAAKE DC10</td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Gilson; Pharmacia</td><td>Gilson MINIPULS 3; Pharmacia P-3</td><td></td></tr><tr><td>提睾肌固定板</td><td>萨斯喀彻温大学</td><td></td><td>自制</td></tr></tbody></table>

通过活体视频显微镜追踪中性粒细胞在组织内的管腔内爬行、跨内皮迁移及趋化运动

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

白细胞从血液循环募集到炎症组织是炎症反应中一个关键而复杂的过程1,2在炎症组织的毛细血管后微静脉中，白细胞首先在微静脉壁管腔表面发生黏附并滚动。滚动的白细胞在接收到微静脉表面趋化因子或其他趋化因子信号后，停止滚动，与内皮细胞牢固黏附。许多黏附的白细胞从初始黏附部位迁移至内皮细胞连接处的血管外渗位点，该过程称为管腔内爬行。3在爬行之后，白细胞穿过内皮（跨内皮迁移），并向趋化因子源方向在血管外组织中迁移（趋化作用）。4活体显微成像技术是观察白细胞与内皮细胞相互作用的有力工具 体内 揭示白细胞募集的细胞与分子机制2,5在本报告中，我们全面描述了使用明场活体显微镜观察和确定中性粒细胞在小鼠提睾肌中响应中性粒细胞趋化因子梯度时招募过程的详细步骤。为诱导中性粒细胞招募，将一小块琼脂糖凝胶（约1毫米）3 大小）含有中性粒细胞趋化因子MIP-2（CXCL2，一种CXC趋化因子）或WKYMVm（Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met，一种细菌肽的合成类似物）的琼脂糖凝胶被放置在靠近所观察微静脉的肌肉组织上。通过延时视频显微摄影结合计算机软件ImageJ，可对中性粒细胞在内皮腔内的爬行、跨内皮迁移以及在组织中的迁移和趋化行为进行可视化观察与追踪。该方案可实现对多种中性粒细胞募集参数的可靠且定量的分析，包括腔内爬行速度、跨内皮迁移时间、脱离时间、迁移速度、趋化速度及趋化指数等。我们证明，采用此方案可稳定测定上述中性粒细胞募集参数，并方便地追踪单个细胞的运动过程 体内.

我们描述了一种用于在中性粒细胞趋化因子刺激下，中性粒细胞募集过程中动态测量中性粒细胞与内皮细胞相互作用的明场活体显微镜技术方案。 体内通过延时视频显微摄影技术在小鼠提睾肌组织中可视化中性粒细胞管腔内爬行、跨内皮迁移及趋化运动，并使用ImageJ软件进行追踪分析。

白细胞从血液循环中募集到炎症组织是炎症过程中一个关键且复杂的过程1,2。在……

本实验方案的总体目标是利用明场、活体显微和延时视频摄影技术，在体内研究中性粒细胞趋化因子诱导的中性粒细胞募集过程中，中性粒细胞与内皮细胞之间的动态相互作用。在本视频中，我们演示了如何使用明场活体视频显微技术，观察并确定小鼠骨骼肌组织中中性粒细胞在管腔内的爬行、穿越内皮细胞的迁移以及趋化运动。白细胞募集是炎症反应的标志性特征。当血液中的白细胞开始在炎症部位的毛细血管后微静脉内皮上滚动时，这一招募过程即被启动。在血管表面趋化因子或其他趋化吸引物的刺激下，滚动的白细胞停止移动，并牢固地黏附于内皮细胞上。黏附后，许多白细胞在管腔表面爬行，似乎在寻找最佳的跨内皮迁移位点。在白细胞沿内皮移动之后，会穿过内皮层，此过程称为跨内皮迁移。随后，中性粒细胞在血管外组织中向炎症部位的趋化因子源定向迁移，该过程称为趋化作用。本视频展示了如何利用明场活体视频、显微时间延时摄影以及ImageJ软件，来观察、追踪并分析中性粒细胞在骨骼肌组织中的管腔内爬行、跨内皮迁移以及趋化迁移过程，及其对中性粒细胞趋化因子源的响应。大家好，我是来自萨斯喀彻温大学医学院药理学系的Lis Liu。今天我们将向您展示如何制备中性粒细胞趋化性琼脂凝胶，以及如何准备小鼠骨骼肌用于活体显微镜观察。如何利用MEGJ追踪细胞运动。最后，我们实验室的两名研究生，ngel Naja, sh, 和 Chile 将向您展示详细的实验步骤。大家好，我是Naja Sh。大家好，我是Chile。开始本实验时，首先准备中性粒细胞趋化因子，使用移液器将10毫升的2倍浓度PBS加入50毫升锥形管中。将锥形管放入盛有热水的烧杯中以预热。再用移液器吸取10毫升蒸馏水。加入0.4克琼脂粉至另一个50毫升锥形管中。将混合物在微波炉中加热至即将沸腾，以制备PBS中的2%琼脂溶液。将温热的PBS溶液以两倍体积加入至琼脂溶液管中。轻轻旋转混匀混合溶液，并将其置于盛有热水的烧杯中保温。取三微升印度墨水加入到1.5毫升离心管盖内的趋化因子溶液中，充分混匀。混匀过程中避免产生气泡。剪去一个200微升枪头的尖端，用微量移液器将110微升42摄氏度的农杆菌溶液加入盖子中，并立即充分混匀。使用另一个枪头将含有该趋化因子的凝胶保存在冰箱中，待用。通过腹腔注射赛拉嗪和氯胺酮混合物，对一只成年雄性小鼠进行麻醉。用电动剃须刀剃除右侧颈外静脉及阴囊前部区域的毛发。麻醉后使用电动剃须刀时，需特别注意并小心处理已麻醉的小鼠。可使用加热灯以防止小鼠体温过低。小鼠应无疼痛反射。做一横向切口，找到颈静脉，并使用充满每毫升含100单位肝素生理盐水的PE 10导管进行插管。将固定板连接至37摄氏度的水循环系统，以保持提睾肌及小鼠主体的温度。用脐带绳将小鼠后肢固定在 cremaster 肌肉板上，使小鼠仰卧。在阴囊皮肤上做切口以暴露左侧 cremaster 肌肉。仔细将肌肉与其周围的筋膜分

tracking-neutrophil-intraluminal-crawling-transendothelial-migration

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

追踪中性粒细胞腔内的爬行，活体视频显微镜Transendothelial组织中的迁移和趋化

本文介绍了一种无创的双光子（2P）显微成像方法，用于研究小鼠足垫中的白细胞归巢过程。我们讨论了组织成像制备过程中的技术细节，并指导读者完成从初始设置到实验实施及数据采集的典型实验流程。...

白细胞归巢与迁移的非侵入性成像 体内

本文首先描述了一种从人脐静脉中分离内皮细胞的实验步骤，然后展示了如何利用这些细胞在流动条件下研究中性粒细胞的跨内皮迁移。通过使用由具有玻璃光学特性的聚合物制成的低体积流动腔室，还可实现对稀有细胞群体的活细胞荧光成像。...

人脐静脉内皮细胞的分离及其在流动条件下中性粒细胞跨内皮迁移研究中的应用

白细胞通过细胞旁路或跨细胞途径穿过内皮单层。我们建立了一种简单的方法，用于在生理流动条件下追踪内源性连接蛋白VE-cadherin和PECAM-1在白细胞跨内皮迁移过程中的分布，以区分这两种迁移途径。...

生理流动条件下中性粒细胞跨内皮迁移过程中内皮细胞间连接的实时成像

我们详细介绍了一种利用活体共聚焦显微镜在麻醉小鼠的肠系膜静脉中监测中性粒细胞和单核细胞在稳态及炎症条件下行为的实验方案。...

通过活体显微镜实时成像麻醉小鼠肠系膜静脉中的中性粒细胞和单核细胞

本实验方案采用荧光报告基因、体内标记和活体成像技术，以实现对活体动物中中性粒细胞预激活动态过程的监测。...

利用IL-1β启动子驱动的DsRed报告小鼠进行中性粒细胞活化的活体成像

我们介绍了一种利用倒置旋转盘共聚焦显微镜对小鼠小肠进行活体成像，以观察表达GFP标记的γδ上皮内淋巴细胞（γδ...

小鼠小肠上皮内淋巴细胞的活体成像

本文展示了如何对小鼠提睾肌的毛细血管后微静脉进行活体显微观察。该技术常用于研究不同类型的炎症和脓毒症模型，尤其是由趋化因子和细胞因子诱导的模型，本文强调了其在研究伴有显著肌肉白细胞浸润的肌病中的重要性。...

通过活体显微镜评估小鼠 cremaster 肌肉中的白细胞浸润

本文介绍了利用延时相差显微镜技术，在趋化性补体C5a梯度中对小鼠腹腔常驻巨噬细胞进行成像的方法。该方案可推广至其他免疫细胞的研究。...

小鼠巨噬细胞趋化作用的延时成像

中性粒细胞的迁移依赖于质膜在趋化因子作用及其与细胞外微环境相互作用下发生的快速而持续的重塑。本文介绍了一种基于活体亚细胞显微镜的技术，用于研究注射至麻醉小鼠耳部的中性粒细胞中质膜重塑的动态过程。...

在生理条件下通过小鼠皮肤成像研究中性粒细胞迁移及亚细胞膜重塑

本方案提供了一种原代小鼠T细胞分离的方法，以及在特定环境条件下对T细胞迁移进行延时显微成像并进行定量分析的技术。...

原代小鼠CD8+ T细胞的实时体外迁移实验

体内关节成像是一种有价值的技術，可用於揭示白細胞在發炎關節中的遷移行為以及分子動態。本文中，我們介紹了一種利用II型膠原誘導關節炎（CIA）小鼠模型進行體內關節成像的詳細實驗方案。...

体内成像揭示白细胞在关节内的迁移行为

学习使用明场活体显微镜和延时摄影技术，在小鼠提睾肌组织中实时追踪中性粒细胞的管腔内爬行、跨内皮迁移和趋化运动。该方法为研究炎症反应中的白细胞募集机制提供了重要的可视化工具。

通过活体视频显微镜追踪中性粒细胞在组织内的管腔内爬行、跨内皮迁移及趋化运动

探索更多视频