通过活体视频显微镜追踪中性粒细胞在组织内的管腔内爬行、跨内皮迁移及趋化运动

本实验方案的总体目标是利用明场、活体显微和延时视频摄影技术，在体内研究中性粒细胞趋化因子诱导的中性粒细胞募集过程中，中性粒细胞与内皮细胞之间的动态相互作用。在本视频中，我们演示了如何使用明场活体视频显微技术，观察并确定小鼠骨骼肌组织中中性粒细胞在管腔内的爬行、穿越内皮细胞的迁移以及趋化运动。白细胞募集是炎症反应的标志性特征。

当血液中的白细胞开始在炎症部位的毛细血管后微静脉内皮上滚动时，这一招募过程即被启动。在血管表面趋化因子或其他趋化吸引物的刺激下，滚动的白细胞停止移动，并牢固地黏附于内皮细胞上。黏附后，许多白细胞在管腔表面爬行，似乎在寻找最佳的跨内皮迁移位点。

在白细胞沿内皮移动之后，会穿过内皮层，此过程称为跨内皮迁移。随后，中性粒细胞在血管外组织中向炎症部位的趋化因子源定向迁移，该过程称为趋化作用。本视频展示了如何利用明场活体视频、显微时间延时摄影以及ImageJ软件，来观察、追踪并分析中性粒细胞在骨骼肌组织中的管腔内爬行、跨内皮迁移以及趋化迁移过程，及其对中性粒细胞趋化因子源的响应。

大家好，我是来自萨斯喀彻温大学医学院药理学系的Lis Liu。今天我们将向您展示如何制备中性粒细胞趋化性琼脂凝胶，以及如何准备小鼠骨骼肌用于活体显微镜观察。

如何利用MEGJ追踪细胞运动。最后，我们实验室的两名研究生，ngel Naja, sh, 和 Chile 将向您展示详细的实验步骤。大家好，我是Naja Sh。大家好，我是Chile。

开始本实验时，首先准备中性粒细胞趋化因子，使用移液器将10毫升的2倍浓度PBS加入50毫升锥形管中。将锥形管放入盛有热水的烧杯中以预热。再用移液器吸取10毫升蒸馏水。

加入0.4克琼脂粉至另一个50毫升锥形管中。将混合物在微波炉中加热至即将沸腾，以制备PBS中的2%琼脂溶液。将温热的PBS溶液以两倍体积加入至琼脂溶液管中。

轻轻旋转混匀混合溶液，并将其置于盛有热水的烧杯中保温。取三微升印度墨水加入到1.5毫升离心管盖内的趋化因子溶液中，充分混匀。混匀过程中避免产生气泡。

剪去一个200微升枪头的尖端，用微量移液器将110微升42摄氏度的农杆菌溶液加入盖子中，并立即充分混匀。使用另一个枪头将含有该趋化因子的凝胶保存在冰箱中，待用。通过腹腔注射赛拉嗪和氯胺酮混合物，对一只成年雄性小鼠进行麻醉。

用电动剃须刀剃除右侧颈外静脉及阴囊前部区域的毛发。麻醉后使用电动剃须刀时，需特别注意并小心处理已麻醉的小鼠。可使用加热灯以防止小鼠体温过低。

小鼠应无疼痛反射。做一横向切口，找到颈静脉，并使用充满每毫升含100单位肝素生理盐水的PE 10导管进行插管。将固定板连接至37摄氏度的水循环系统，以保持提睾肌及小鼠主体的温度。

用脐带绳将小鼠后肢固定在 cremaster 肌肉板上，使小鼠仰卧。在阴囊皮肤上做切口以暴露左侧 cremaster 肌肉。仔细将肌肉与其周围的筋膜分离。

将提睾肌与37摄氏度预温的碳酸氢盐缓冲盐水进行超级灌注。在提睾肌远端结扎一根4.0缝线，以将其固定在提睾肌观察板的透明观察玻璃基座上。使用电灼器沿纵轴方向对提睾肌进行电灼，并使用4-0缝线。

将肌肉平放并固定在基座边缘。分离睾丸和附睾与下方肌肉组织，并将其移入腹腔。在 22 × 22 毫米的玻璃盖玻片相对的两边涂上一层薄薄的真空脂。

然后用玻璃盖玻片覆盖暴露的肌肉。将主肌肉板放置在显微镜载物台上。在显微镜下观察肌肉，并找到合适的后微静脉。

选择一个具有正常剪切速率且直径在25至40微米之间的微静脉。调整视频摄像机，使该微静脉在电视监视器的右侧或左侧末端呈垂直方向显示。30分钟后，使用视频记录设备（如DVD录像机）记录所选后微静脉的视频图像，作为基线对照数据。

这是后微静脉的基线对照视频图像。在将含有趋化因子的凝胶放置于提睾肌表面之前，停止灌流，并移除覆盖在肌肉上的玻璃盖玻片。从Eppendorf管盖上切取一块1立方毫米大小的含有趋化因子的凝胶，使用剪切过的200微升移液器吸头末端，将该含有趋化因子的凝胶置于提睾肌表面预先选定的区域，距离观察到的后微静脉350微米处。

加盖盖玻片以固定凝胶，并以非常缓慢的速度（小于或等于每分钟10 µL）灌注肌肉组织，使趋化因子梯度得以建立，该梯度由凝胶缓慢释放并形成。在加入含趋化因子的凝胶后，连续记录90分钟的视频图像。记录期间，调节并保持显微镜焦点，观察血管内及肌肉组织中黏附、爬行、跨内皮迁移和趋化运动的白细胞。

实验结束后，将视频文件导入计算机。为了在计算机上进行分析，需提取视频并将其转换为 VI 格式。例如，可使用免费的计算机软件 Bit Ripper 将 DVD 视频转换为 A VI 文件。

使用视频编辑软件（例如 Windows Movie Maker），将原始实时视频制作成延时电影，并将延时电影转换并保存为 DV AVI 格式。在相同的显微镜设置下拍摄校准微尺的图像，并将图像导入计算机。

使用 ImageJ 打开图像。测量图像在 X 轴和 Y 轴方向的尺寸，并计算每微米对应的像素数。导入视频时，再次打开 ImageJ，点击“文件”→“导入”，使用 QuickTime 视频插件，选择待分析的视频，然后在 QT 视频打开界面中点击“确定”。接着点击“插件”→“手动追踪”以追踪细胞。在开始追踪前，需在屏幕底部的相应字段中填写相关信息，并确定以下参数：追踪时间。

时间间隔（秒）为总时长除以30。xy校准是通过显微尺图像校准获得的微米/像素测量值。z轴校准设置为零。用于定位的搜索方框大小等于1。必须在录制的视频中选择一个稳定且清晰的点作为参考点。该参考点可以是实验全程中保持不变且稳定的任何清晰微小结构点。

单击“添加轨迹”以追踪从第一帧到最后一帧的参考点。然后逐个单击并追踪爬行和迁移的中性粒细胞。单击“添加轨迹”以追踪细胞从其在组织中出现到在每一帧中消失的全过程。

然后单击并跟踪以完成操作，并将结果保存到 Microsoft Excel 中。在 Microsoft Excel 中打开结果文件，开始分析数据。

在分析过程中，必须考虑参考点的运动。在追踪中性粒细胞和管腔内爬行时，我们测定中性粒细胞的爬行距离和爬行速度。在分析中性粒细胞跨内皮迁移时，我们测量中性粒细胞的跨膜迁移时间以及脱离时间。

在确定中性粒细胞向骨骼肌组织趋化迁移的过程中，我们测量中性粒细胞在肌肉组织内的迁移距离和迁移速度，并评估中性粒细胞在肌肉组织中趋化迁移的趋化指数。这些参数的定义如屏幕所示，已在我们的书面实验方案中详细说明。在本实验中，我们演示了如何使用明场活体显微镜观察并测定中性粒细胞在血管内腔的爬行、穿越内皮细胞的迁移以及趋化迁移过程。

为了响应体内中性粒细胞趋化因子，我们使用了MIP-2（CXCL2）或合成肽W-K-Y-M-V-M，制备了琼脂凝胶以诱导小鼠CMA肌肉组织中的中性粒细胞募集。从该图中可以看出，0.5 µM的MIP-2和0.1 mM的W-K-Y-M-V-M诱导中性粒细胞在管腔内爬行的速度相似。中性粒细胞的跨内皮迁移以及从中性静脉脱离所需的时间也具有可比性。

这两种趋化因子在肌肉组织中诱导中性粒细胞迁移和趋化，其迁移速度几乎相同，且中性粒细胞趋化指数相似。活体显微镜是直接观察中性粒细胞募集过程以及定量确定各募集步骤中细胞和分子功能的有力工具。通过使用延时视频摄影和ImageJ软件，可在明场、活体显微条件下，结合选择性抑制剂、转基因小鼠和选择性趋化因子，对白细胞在管腔内爬行、跨内皮迁移以及在组织中的趋化迁移进行测量。

该检测系统有助于揭示特定蛋白质在白细胞募集中的功能。